Bu protokol, araştırmacıların deneysel tasarımlarına dayanarak uygun stratejileri seçmelerini sağlamak için özofagus adenokarsinom organoidlerinin tek hücreli sindirimli ve tek hücreli sindirimsiz alt kültür ve kriyoprezervasyon yöntemlerini açıklamaktadır.
Tümörigenezi ve tedavi stratejilerini araştırmak için primer hastalığı yansıtan uygun translasyonel araştırma modellerinin bulunmaması, özofagus adenokarsinomunda (EAC) önemli bir engeldir. Hasta kaynaklı organoidler (PDO’lar) son zamanlarda çeşitli kanserlerde dikkate değer bir klinik öncesi model olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, EAC PDO’ları geliştirmek için hala sınırlı protokoller bulunmaktadır. PDO’lar kurulduktan sonra, yayılma ve kriyoprezervasyon, daha sonraki aşağı akış analizleri için gereklidir. Burada, EAC PDO’ların alt kültürü ve kriyoprezervasyonu, yani tek hücreli sindirimli ve sindirimsiz olmak üzere iki farklı yöntem standartlaştırılmıştır. Her iki yöntem de uygun hücre canlılığını güvenilir bir şekilde elde edebilir ve çeşitli deneysel kurulumlar için uygulanabilir. Mevcut çalışma, EAC PDO’ların tek hücreli sindirimle alt kültürlenmesinin, hücre numarası kontrolü, homojen yoğunluk ve boyut izlemeyi kolaylaştıran içi boş bir yapı gerektiren çoğu deney için uygun olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, tek hücreli yöntem, kültürde ve dondurulmuş stoklardan yeniden ekimden sonra daha yavaş büyüme göstermektedir. Ayrıca, tek hücreli sindirim ile alt kültürleme, içi boş bir çekirdeğe sahip içi boş yapılar oluşturarak karakterize edilir. Buna karşılık, EAC PDO’ların tek hücreli sindirim olmadan işlenmesi kriyoprezervasyon, genişleme ve histolojik karakterizasyon için elverişlidir. Bu protokolde, araştırmacıların organoidlerini işlemek ve araştırmak için uygun bir yöntem seçmelerini sağlamak için EAC PDO’ların tek hücreli sindirimli ve tek hücreli sindirimsiz alt kültürlenmesi ve kriyoprezervasyonunun avantajları ve dezavantajları açıklanmaktadır.
Özofagus kanseri (EC), dünya çapında kanserden kaynaklanan ölümlerin onuncu en yaygın ve altıncı önde gelen nedenidir1. Özofagus adenokarsinomu (EAK) EK’nin başlıca histolojik alt tiplerinden biridir ve esas olarak batı ülkelerinde görülür2. Son on yılda, EAC insidansı, Almanya3 de dahil olmak üzere birçok gelişmiş ülkede önemli ölçüde artmıştır. Kanserin agresifliği ve tümör gelişiminin erken evresinde semptomların olmaması nedeniyle, EAC hastalarında genel prognoz kötüdür ve 5 yıllık sağkalım oranı yaklaşık% 20,4,5’tir.
Yirminci yüzyılın sonlarından bu yana, EAC’nin biyomedikal araştırmaları için çeşitli modeller oluşturulmuştur. 1990’larda kurulan klasik insan EAC hücre hatları6, EAC tümör biyolojisi, tümör genetiği ve anti-tümör stratejileri hakkındaki bilgimizi genişletir ve EAC araştırmalarında yaygın olarak kullanılır. Ayrıca, bazı araştırma grupları, cerrahi veya enflamatuar yaklaşımlarla hayvanları gastroözofageal reflü gibi bilinen risk faktörlerine maruz bırakarak EAC veya Barrett özofagusunun hayvan modellerini başarıyla geliştirmiştir 7,8,9. Ek olarak, EAC primer kanser dokularını deri altından veya ortopik olarak immün yetmezlikli farelere aşılayan hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri, insan EAC tümör biyolojik davranışını ve tümör ortamını simüle etmek için geliştirilmiştir10,11,12. Bununla birlikte, klinik uygulamaları geliştiren bu modellere ve EAC tümörigenezi ve progresyonunun arkasındaki moleküler mekanizmaları anlamamıza rağmen, bu araştırma modellerinden elde edilen sonuçları insanlara tahmin etmek için hala büyük bir zorluk vardır.
Hasta kaynaklı tümör organoidleri (PDO’lar), in vitro olarak insan gelişimini ve organ yenilenmesini taklit eden bir 3D kültür sisteminde yetiştirilir. Hastaların birincil dokusundan üretilen PDO’lar, insan tümörünün moleküler ve fenotipik özelliklerini özetlemekte ve ilaç geliştirme ve kişiselleştirilmiş kanser tedavisinde umut verici uygulamalar göstermiştir13,14. On EAC PDO vakasını eşleştirilmiş tümör dokusu ile karşılaştırarak, EAC PDO’ların primer tümörle benzer histopatolojik özellikleri ve genomik manzarayı paylaştığı, tümör içi heterojeniteyi koruduğu ve in vitro15’te etkili ilaç taramasını kolaylaştırdığı bildirilmiştir. EAC PDO’lar, EAC tümör hücrelerinin hasta kaynaklı kanserle ilişkili fibroblastlarla (CAF’lar) etkileşimini incelemede de kullanılmıştır, bu da tümör mikroçevre araştırması alanında güçlü bir uygulamaya işaret etmektedir16. Ne yazık ki, EAC PDO’ları geliştirmek ve yaymak için sınırlı protokoller mevcuttur. Burada, EAC PDO’ların alt kültürlenmesi ve korunması için iki farklı yöntem ayrıntılı olarak açıklanmaktadır: tek hücreli sindirim ile ve sindirimsiz. EAC PDO’ların ve uygulamalarının bakımı için standartlaştırılmış yöntemler, araştırmacıların EAC PDO araştırmalarında farklı amaçlar için uygun yöntemleri seçmelerini destekleyebilir.
Bu protokolde EAC PDO’ların iki farklı alt kültür ve kriyoprezervasyon yöntemi, yani tek hücreli sindirimli ve sindirimsiz olarak tanımlanmıştır. Birçok çalışma, EAC PDO’ların tek hücreli sindirim15,17 ile geçişini önerdi; bu, hücre numarası kontrolü, tekdüze yoğunluk ve boyut izlemeyi kolaylaştıran içi boş bir yapı gerektiren çoğu deney için faydalıdır. Bununla birlikte, tek hücreli yöntem, dondurulmuş stoklardan yeniden ekim…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Köln Fortune Programı/Köln Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir. Susanne Neiss, Michaela Heitmann ve Anke Wienand-Dorweiler’in teknik yardımlarına teşekkür ederiz. Ningbo Fan, Guangzhou Elit Burs Konseyi (GESC) tarafından finansal olarak desteklendi. Yazarlar, dilbilimsel düzenlemedeki yardımları için Dr. Joshua D’Rozario’ya teşekkür eder.
Equipment | |||
-20°C Freezer | Bosch | Economic | |
-80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
Material | |||
15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
Reagent/Chemical | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
Gastrin | Sigma | G9020 | |
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
Y-27632 | Sigma | Y0503 |