Dit protocol beschrijft de methoden van subcultuur en cryopreservatie van oesofageale adenocarcinoom organoïden met en zonder eencellige vertering om onderzoekers in staat te stellen geschikte strategieën te kiezen op basis van hun experimentele ontwerp.
Het gebrek aan geschikte translationele onderzoeksmodellen die primaire ziekte weerspiegelen om tumorigenese en therapeutische strategieën te onderzoeken, is een groot obstakel bij oesofageaal adenocarcinoom (EAC). Patient-derived organoids (PDOs) zijn onlangs naar voren gekomen als een opmerkelijk preklinisch model in een verscheidenheid aan kankers. Er zijn echter nog steeds beperkte protocollen beschikbaar voor het ontwikkelen van OAG-BOB’s. Zodra de BOB’s zijn vastgesteld, zijn de vermeerdering en cryopreservatie essentieel voor verdere downstream-analyses. Hier zijn twee verschillende methoden gestandaardiseerd voor EAC PDOs subcultuur en cryopreservatie, d.w.z. met en zonder eencellige vertering. Beide methoden kunnen op betrouwbare wijze de juiste levensvatbaarheid van de cel verkrijgen en zijn toepasbaar voor een diverse experimentele opstelling. De huidige studie toonde aan dat het subcultureren van EAC-BOB’s met eencellige spijsvertering geschikt is voor de meeste experimenten die celnummercontrole, uniforme dichtheid en een holle structuur vereisen die het volgen van de grootte vergemakkelijkt. De op één cel gebaseerde methode laat echter een langzamere groei zien in de teelt en na herkweek uit bevroren bestanden. Bovendien wordt subculturing met eencellige spijsvertering gekenmerkt door het vormen van holle structuren met een holle kern. Daarentegen is het verwerken van EAC-BOB’s zonder eencellige vertering gunstig voor cryopreservatie, expansie en histologische karakterisering. In dit protocol worden de voor- en nadelen beschreven van subculturen en cryopreservatie van EAC BOB’s met en zonder eencellige vertering om onderzoekers in staat te stellen een geschikte methode te kiezen om hun organoïden te verwerken en te onderzoeken.
Slokdarmkanker (EC) is de tiende meest voorkomende en de zesde belangrijkste doodsoorzaak van kanker wereldwijd1. Oesofageaal adenocarcinoom (EAC) is een van de belangrijkste histologische subtypen van EC en komt voornamelijk voor in westerse landen2. In het afgelopen decennium is de EAC-incidentie aanzienlijk toegenomen in veel ontwikkelde landen, waaronder Duitsland3. Vanwege de agressiviteit van kanker en het ontbreken van symptomen tijdens het vroege stadium van tumorontwikkeling, is de algemene prognose bij EAC-patiënten slecht, met een 5-jaarsoverleving van ongeveer 20% 2,4,5.
Sinds het einde van de twintigste eeuw zijn er verschillende modellen opgesteld voor het biomedisch onderzoek van EAC. De klassieke menselijke EAC-cellijnen die werden opgericht in de jaren 19906, breiden onze kennis van EAC-tumorbiologie, tumorgenetica en antitumorstrategieën uit en worden vaak gebruikt in EAC-onderzoek. Bovendien hebben sommige onderzoeksgroepen met succes diermodellen van EAC of Barrett’s slokdarm ontwikkeld door de dieren bloot te stellen aan bekende risicofactoren zoals gastro-oesofageale reflux door chirurgische of inflammatoire benaderingen 7,8,9. Daarnaast werden patiënt-afgeleide xenograft (PDX) modellen die EAC primaire kankerweefsels subcutaan of orthotopisch enten in immunodeficiënte muizen, ontwikkeld om menselijk EAC tumor biologisch gedrag en tumoromgeving te simuleren 10,11,12. Ondanks dat deze modellen klinische toepassingen verbeteren en ons begrip van moleculaire mechanismen achter EAC-tumorigenese en progressie, is er nog steeds een grote uitdaging om de resultaten van deze onderzoeksmodellen naar mensen te extrapoleren.
Patiënt-afgeleide tumor organoïden (BOB’s) worden gekweekt in een 3D-kweeksysteem dat de menselijke ontwikkeling en orgaanregeneratie in vitro nabootst. Gegenereerd uit het primaire weefsel van patiënten, reconstrueren PDO’s de moleculaire en fenotypische kenmerken van de menselijke tumor en hebben veelbelovende toepassingen aangetoond bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en gepersonaliseerde kankerbehandeling13,14. Door tien gevallen van EAC-BOB’s te vergelijken met hun gepaarde tumorweefsel, wordt gemeld dat EAC-BOB’s vergelijkbare histopathologische kenmerken en genomisch landschap delen met de primaire tumor, intratumorering heterogeniteit behouden en efficiënte screening van geneesmiddelen in vitro15 vergemakkelijken. EAC PDO’s werden ook gebruikt bij het bestuderen van de interactie van EAC-tumorcellen met patiënt-afgeleide kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs), wat wijst op een krachtige toepassing op het gebied van tumormicro-omgevingsonderzoek16. Helaas zijn er beperkte protocollen beschikbaar voor het ontwikkelen en verspreiden van EAC-BOB’s. Hier worden twee verschillende methoden beschreven voor het subcultureren en conserveren van EAC-BOB’s in detail: met en zonder eencellige vertering. De gestandaardiseerde methoden voor het onderhoud van EAC BOB’s en hun toepassingen kunnen onderzoekers ondersteunen bij het kiezen van geschikte methoden voor verschillende doeleinden in hun EAC BOB-onderzoek.
In dit protocol worden twee verschillende subcultuur- en cryopreservatiemethoden van EAC-BOB’s beschreven, namelijk met en zonder eencellige vertering. Verschillende studies adviseerden het doorgeven van EAC-BOB’s met eencellige vertering15,17, wat gunstig is voor de meeste experimenten die celnummercontrole, uniforme dichtheid en een holle structuur vereisen die het volgen van de grootte vergemakkelijkt. De op één cel gebaseerde methode wordt echter gekenmerkt…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door Köln Fortune Program / Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van Keulen. Wij danken de technische assistentie van Susanne Neiss, Michaela Heitmann en Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan werd financieel ondersteund door Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). De auteurs bedanken Dr. Joshua D’Rozario voor zijn hulp bij het taalkundig bewerken.
Equipment | |||
-20°C Freezer | Bosch | Economic | |
-80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
Material | |||
15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
Reagent/Chemical | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
Gastrin | Sigma | G9020 | |
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
Y-27632 | Sigma | Y0503 |