食道腺癌オルガノイドの継代培養と凍結保存:単一細胞消化の長所と短所
Summary
このプロトコルは、単一細胞消化の有無にかかわらず食道腺癌オルガノイドの継代培養および凍結保存の方法を記述し、研究者が実験計画に基づいて適切な戦略を選択できるようにする。
Abstract
腫瘍形成および治療戦略を探求するための原疾患を反映する適切なトランスレーショナルリサーチモデルの欠如は、食道腺癌(EAC)における大きな障害である。患者由来のオルガノイド(PDO)は、最近、様々な癌における顕著な前臨床モデルとして浮上している。ただし、EAC PDO の開発に使用できるプロトコルはまだ限られています。PDO が確立されると、伝播と凍結保存は、さらに下流の解析に不可欠です。ここでは、EAC PDOの継代培養および凍結保存のために、すなわち、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる方法が標準化されている。どちらの方法も、適切な細胞生存率を確実に得ることができ、多様な実験セットアップに適用可能である。現在の研究は、単一細胞消化によるEAC PDOの継代培養が、細胞数制御、均一な密度、およびサイズ追跡を容易にする中空構造を必要とするほとんどの実験に適していることを実証した。しかしながら、単一細胞ベースの方法は、培養中および凍結ストックからの再培養後に遅い成長を示す。また、単一細胞消化による継代培養は、中空コアで中空構造を形成することを特徴とする。対照的に、単一細胞消化なしでEAC PDOを処理することは、凍結保存、拡張、および組織学的特徴付けに有利である。このプロトコルでは、単一細胞消化の有無にかかわらずEAC PDOの継代培養および凍結保存の長所と短所が説明されており、研究者はオルガノイドを処理および調査するための適切な方法を選択できます。
Introduction
食道がん(EC)は、世界のがんによる死亡原因の第10位および第6位の死因1位です。食道腺癌(EAC)は、ECの主要な組織学的サブタイプの1つであり、主に西洋諸国で発生する2。ここ10年間で、EACの発生率はドイツを含む多くの先進国で大幅に増加しています3。がんの攻撃性および腫瘍発生の初期段階における症状の欠如のために、EAC患者の全体的な予後は悪く、約20%の5年生存率を示す2、4、5。
20世紀後半以来、EACの生物医学研究のためにいくつかのモデルが確立されてきました。1990年代に確立された古典的なヒトEAC細胞株6は、EAC腫瘍生物学、腫瘍遺伝学、抗腫瘍戦略に関する知識を拡張し、EAC研究で一般的に使用されています。その上、いくつかの研究グループは、外科的または炎症的アプローチを介して胃食道逆流などの既知の危険因子に動物を曝露することによって、EACまたはバレット食道の動物モデルの開発に成功している7,8,9。加えて、EAC原発性癌組織を皮下または同所性に免疫不全マウスに生着させる患者由来異種移植片(PDX)モデルが、ヒトEAC腫瘍の生物学的挙動および腫瘍環境をシミュレートするために開発された10、11、12。しかし、これらのモデルが臨床応用を改善し、EACの腫瘍形成と進行の背後にある分子メカニズムの理解を向上させているにもかかわらず、これらの研究モデルからヒトに結果を推定することは依然として大きな課題があります。
患者由来の腫瘍オルガノイド(PDO)は、インビトロでヒトの発達および臓器再生を模倣する3D培養系で増殖される。患者の原発組織から生成されるPDOは、ヒト腫瘍の分子的および表現型的特徴を再現し、医薬品開発および個別化がん治療における有望な用途を示している13,14。EAC PDOの10例を対になった腫瘍組織と比較することにより、EAC PDOは原発腫瘍と同様の組織病理学的特徴およびゲノムランドスケープを共有し、腫瘍内の不均一性を保持し、インビトロでの効率的な薬物スクリーニングを促進することが報告されている15。EAC PDOは、EAC腫瘍細胞と患者由来の癌関連線維芽細胞(CAF)との相互作用の研究にも使用され、腫瘍微小環境研究の分野における強力な応用を示している16。残念ながら、EAC PDO の開発と伝達に使用できるプロトコルは限られていました。ここでは、EAC PDOの継代培養と保存について、単一細胞消化の有無にかかわらず、2つの異なる方法を詳細に説明します。EAC PDOとそのアプリケーションのメンテナンスのための標準化された方法は、研究者がEAC PDO研究におけるさまざまな目的に適した方法を選択するのを支援することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、EAC PDOの2つの異なる継代培養および凍結保存方法、すなわち単一細胞消化の有無にかかわらず記載されている。いくつかの研究では、単一細胞消化15,17によるEAC PDOの継代を推奨しており、これは細胞数制御、均一な密度、およびサイズ追跡を容易にする中空構造を必要とするほとんどの実験にとって有益である。しかしながら…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究はケルン大学ケルン・フォーチュン・プログラム/医学部の支援を受けた。Susanne Neiss、Michaela Heitmann、Anke Wienand-Dorweilerの技術支援に感謝します。寧波ファンは広州エリート奨学金評議会(GESC)から財政的支援を受けました。著者らは、言語編集におけるジョシュア・ドロザリオ博士の協力に感謝する。
Materials
| Equipment | |||
| -20°C Freezer | Bosch | Economic | |
| -80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
| Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
| Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
| Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
| Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
| Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
| Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
| Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
| Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
| Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
| Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
| Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
| Material | |||
| 15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
| Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
| Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
| Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
| Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
| Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
| Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
| Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
| Reagent/Chemical | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
| Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
| Gastrin | Sigma | G9020 | |
| Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
| Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
| Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
| SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
| Y-27632 | Sigma | Y0503 |
References
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