Ce protocole décrit les méthodes de sous-culture et de cryoconservation des organoïdes de l’adénocarcinome de l’œsophage avec et sans digestion unicellulaire pour permettre aux chercheurs de choisir des stratégies appropriées en fonction de leur conception expérimentale.
Le manque de modèles de recherche translationnelle appropriés reflétant la maladie primaire pour explorer la tumorigenèse et les stratégies thérapeutiques est un obstacle majeur dans l’adénocarcinome de l’œsophage (CAE). Les organoïdes dérivés du patient (AOP) sont récemment apparus comme un modèle préclinique remarquable dans une variété de cancers. Cependant, il existe encore peu de protocoles disponibles pour le développement des AOP EAC. Une fois les AOP établies, la propagation et la cryoconservation sont essentielles pour d’autres analyses en aval. Ici, deux méthodes différentes ont été normalisées pour la sous-culture et la cryoconservation des PDO EAC, c’est-à-dire avec et sans digestion unicellulaire. Les deux méthodes peuvent obtenir de manière fiable la viabilité cellulaire appropriée et sont applicables à une configuration expérimentale diversifiée. L’étude actuelle a démontré que la sous-culture des AOP EAC avec digestion unicellulaire convient à la plupart des expériences nécessitant un contrôle du nombre de cellules, une densité uniforme et une structure creuse qui facilite le suivi de la taille. Cependant, la méthode à base de cellules uniques montre une croissance plus lente en culture ainsi qu’après une nouvelle culture à partir de stocks congelés. En outre, la sous-culture avec digestion unicellulaire se caractérise par la formation de structures creuses avec un noyau creux. En revanche, le traitement des AOP EAC sans digestion unicellulaire est favorable à la cryoconservation, à l’expansion et à la caractérisation histologique. Dans ce protocole, les avantages et les inconvénients de la sous-culture et de la cryoconservation des AOP EAC avec et sans digestion unicellulaire sont décrits pour permettre aux chercheurs de choisir une méthode appropriée pour traiter et étudier leurs organoïdes.
Le cancer de l’œsophage (EC) est la dixième cause de décès par cancer dans le monde1. L’adénocarcinome de l’œsophage (CAE) est l’un des principaux sous-types histologiques de la CE et survient principalement dans les pays occidentaux2. Au cours de la dernière décennie, l’incidence de la CAE a considérablement augmenté dans de nombreux pays développés, y compris en Allemagne3. En raison de l’agressivité du cancer et de l’absence de symptômes au stade précoce du développement de la tumeur, le pronostic global chez les patients atteints de CAE est mauvais, montrant un taux de survie à 5 ans d’environ 20%2,4,5.
Depuis la fin du XXe siècle, plusieurs modèles ont été établis pour la recherche biomédicale de l’EAC. Les lignées cellulaires EAC humaines classiques qui ont été établies dans les années 19906, étendent nos connaissances de la biologie tumorale EAC, de la génétique tumorale ainsi que des stratégies anti-tumorales, et sont couramment utilisées dans la recherche EAC. En outre, certains groupes de recherche ont développé avec succès des modèles animaux de l’EAC ou de l’œsophage de Barrett en exposant les animaux à des facteurs de risque connus tels que le reflux gastro-œsophagien par des approches chirurgicales ou inflammatoires 7,8,9. En outre, des modèles de xénogreffe dérivés du patient (PDX) qui greffent des tissus cancéreux primaires EAC par voie sous-cutanée ou orthotopique dans des souris immunodéficientes, ont été développés pour simuler le comportement biologique de la tumeur EAC humaine et l’environnement tumoral 10,11,12. Cependant, malgré l’amélioration des applications cliniques et notre compréhension des mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse et de la progression de l’EAC, il reste un défi majeur à relever pour extrapoler les résultats de ces modèles de recherche à l’homme.
Les organoïdes tumoraux dérivés du patient (PDO) sont cultivés dans un système de culture 3D qui imite le développement humain et la régénération des organes in vitro. Générées à partir du tissu primaire des patients, les PDO récapitulent les caractéristiques moléculaires et phénotypiques de la tumeur humaine et ont montré des applications prometteuses dans le développement de médicaments et le traitement personnalisé du cancer13,14. En comparant dix cas de PDO EAC avec leur tissu tumoral apparié, les PDO EAC partageraient des caractéristiques histopathologiques et un paysage génomique similaires avec la tumeur primaire, conserveraient l’hétérogénéité intra-tumorale et faciliteraient un dépistage efficace des médicaments in vitro15. Les PDO EAC ont également été utilisés dans l’étude de l’interaction des cellules tumorales EAC avec les fibroblastes associés au cancer (CAF) dérivés du patient, indiquant une application puissante dans le domaine de la recherche sur le microenvironnement tumoral16. Malheureusement, il y a eu peu de protocoles disponibles pour développer et propager des AOP EAC. Ici, deux méthodes différentes sont décrites en détail pour la sous-culture et la préservation des AOP EAC: avec et sans digestion unicellulaire. Les méthodes normalisées de maintenance des AOP du CAE et de leurs applications peuvent aider les chercheurs à choisir des méthodes appropriées à différentes fins dans leur recherche sur les AOP du CAE.
Dans ce protocole, deux méthodes différentes de sous-culture et de cryoconservation des AOP EAC sont décrites, c’est-à-dire avec et sans digestion unicellulaire. Plusieurs études ont recommandé de passer les PDO EAC avec une digestion unicellulaire15,17, ce qui est bénéfique pour la plupart des expériences qui nécessitent un contrôle du nombre de cellules, une densité uniforme et une structure creuse qui facilite le suivi de la taille. Cependant, la…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Köln Fortune Program/Faculté de médecine de l’Université de Cologne. Nous remercions l’assistance technique de Susanne Neiss, Michaela Heitmann et Anke Wienand-Dorweiler. Ningbo Fan a été soutenu financièrement par le Guangzhou Elite Scholarship Council (GESC). Les auteurs remercient le Dr Joshua D’Rozario pour son aide dans l’édition linguistique.
Equipment | |||
-20°C Freezer | Bosch | Economic | |
-80°C Freezer | Panasonic | MDF DU500VH-PE | |
Automated Cell counter | Thermo Fisher | AMQAX1000 | Countess II |
Biological Safety Cabinet Class II | Thermo Scientific | 51022482 | Herasafe KS12 |
Centrifuge | Heraeus | 75003060 | Megafuge 1.0R |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50116048 | Heracell 150i |
Inverted automated fluorescence microscope | Olympus | IX83 | |
Inverted light microscope | Leica | DMIL LED Fluo | |
Pipette 1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Research Plus |
Pipette 200 µL | Eppendorf | 3123000039 | Research Plus |
Rotating Incubator | Scientific Industries, sc. | SI-1200 | Enviro-genie |
Shaker | Eppendorf | 5355 000.011 | Thermomixer Comfort |
Vacuum pump | Vacuubrand | 20727200 | BVC control |
Waterbath | Medingen | p2725 | W22 |
Material | |||
15 mL tube | Sarstedt | 62.554.502 | Inc Screw cap tube PP 15 mL |
Cryo vial 2 mL | Sarstedt | 72.379 | CryoPure 2.0 mL tube |
Low bind tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.600 | Micro tube 1.5 mL protein LB |
Low bind tube 5 mL | Eppendorf | 0030 108.302 | Protein LoBind Tube 5.0 mL |
Pipette tip 200 µL | Starlab | E1011-8000 | 200 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Starlab | E1011-9000 | 1000 µL Graduated tip, wide orifice |
Pipette tip 1000 µL | Sarstedt | 70.3050 | Pipette tip 1000 µL |
Sterile filter 0.2 µm | Sarstedt | 83.1826.001 | Filtropur 0.2 µm sterile filter |
Tissue culture plate | Sarstedt | 83.3921 | 12 well-plate |
Reagent/Chemical | |||
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182/CS-0181 | |
DNase I grade II, from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
Extracellular matrix (ECM) gel: Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
FGF-10a | Peprotech | 100-26-100 | |
Freezing medium: Recovery Cell Freezing Medium | Thermo Fisher Scientific | 12648010 | |
Gastrin | Sigma | G9020 | |
Gentamicin-25 (25 mg/ 500 µL) | PromoCell | C-36030 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
L-Glutamine 200 mM (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100 | |
Noggin | Peprotech | 120-10C-50 | |
Penicillin-Streptomycin 10,000 U/ mL (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
R-Spondin1 conditioned medium from Cultrex R-Spondin Cells | Biotechne | 3710-001-01 | |
SB202190 | MedChemExpress | 152121-30-7 | |
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | 93620-1G | |
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Wnt-3A conditioned medium | Wnt-3A expressing cell line was kindly provided by Prof. Hans Clevers' group | ||
Y-27632 | Sigma | Y0503 |