Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

Summary

Aquí, se desarrollan modelos animales basados en ratones y conejos para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal para detectar nuevas terapias y el mecanismo subyacente.

Abstract

La lesión corneal en la superficie ocular, incluyendo quemaduras químicas y traumatismos, puede causar cicatrices graves, simblefarón, deficiencia de células madre limbares corneales y provocar un defecto epitelial corneal grande y persistente. El defecto epitelial con la siguiente opacidad corneal y la neovascularización periférica resultan en una discapacidad visual irreversible y dificultan el manejo futuro, especialmente la queratoplastia. Dado que el modelo animal se puede utilizar como una plataforma efectiva de desarrollo de fármacos, aquí se desarrollan modelos de lesión corneal en el ratón y quemaduras alcalinas en el epitelio corneal del conejo. El conejo blanco de Nueva Zelanda se utiliza en el modelo de quema alcalina. Se pueden aplicar diferentes concentraciones de hidróxido de sodio en el área circular central de la córnea durante 30 s bajo anestesia intramuscular y tópica. Después de una copiosa irrigación salina normal isotónica, se eliminó el epitelio corneal suelto residual con rebaba corneal profundamente hasta la capa de Bowman dentro de esta área circular. La cicatrización de heridas se documentó mediante tinción con fluoresceína bajo luz azul cobalto. Se utilizaron ratones C57BL/6 en el modelo traumático de epitelio corneal murino. La córnea central murina se marcó con un punzón de piel, de 2 mm de diámetro, y luego se desbridó con un removedor de anillo de óxido corneal con una rebaba de 0,5 mm bajo un microscopio estereoscópico. Estos modelos se pueden utilizar prospectivamente para validar el efecto terapéutico de gotas para los ojos o agentes mixtos como las células madre, que potencialmente facilitan la regeneración epitelial corneal. Al observar la opacidad corneal, la neovascularización periférica y la congestión conjuntival con estereomicroscopio y software de imágenes, se pueden monitorear los efectos terapéuticos en estos modelos animales.

Introduction

La córnea humana consta de cinco capas principales y desempeña un papel fundamental en la refracción ocular para mantener la agudeza visual y la integridad estructural para proteger los tejidos intraoculares¹. La parte más externa de la córnea es el epitelio corneal, compuesto por cinco a seis capas de células que se diferencian secuencialmente de las células basales y se mueven hacia arriba para desprenderse de la superficie ocular¹. En comparación con la córnea en humanos y conejos de Nueva Zelanda, la córnea de ratón tiene una estructura corneal similar, pero una periferia más delgada que la parte central debido a un grosor reducido en el epitelio y el estroma². Debido a su posición única en el sistema óptico ocular, muchos insultos externos como lesiones mecánicas, inoculación bacteriana y agentes químicos pueden poner en peligro fácilmente la integridad epitelial y provocar un defecto epitelial que amenaza la visión, queratitis infecciosa, fusión corneal e incluso perforación corneal.

Aunque varios agentes terapéuticos, como lubricantes, antibióticos, agentes antiinflamatorios, productos de autosuero y membrana amniótica ya se han utilizado para mejorar la reepitelización y reducir las cicatrices, otras posibles modalidades de tratamiento que pueden permitir la cicatrización de heridas, reducir la inflamación y suprimir la formación de cicatrices todavía se están desarrollando y probando en diferentes plataformas. Se han propuesto varios modelos animales para la cicatrización de heridas epiteliales corneales, incluida la eliminación del epitelio corneal con un removedor de anillo de óxido corneal en ratón diabético³, rasguños lineales sobre el epitelio corneal del ratón mediante una aguja estéril de 25 G para la inoculación bacteriana⁴, eliminación asistida por trepines del epitelio corneal mediante removedor de anillo de óxido corneal⁵, cauterización epitelial sobre la mitad de la córnea y el limbo⁶ , abrasión corneal de conejo facilitada por trefina por una hoja de bisturí opaca⁷, y lesión de la córnea bovina por congelación repentina en nitrógeno líquido⁸.

Además de la lesión mecánica al epitelio corneal, los agentes químicos también son insultos comunes a la superficie ocular, especialmente los agentes ácidos y alcalinos. El hidróxido de sodio (NaOH, 0.1-1 N para 30-60 s) es uno de los productos químicos comúnmente utilizados en modelos murinos y de conejo de quemaduras químicas corneales 9,10,11,12,13. El etanol al 100% también se había aplicado a la córnea en el modelo de quemadura química de rata, seguido de un desguace mecánico adicional utilizando una cuchilla quirúrgica¹⁴. Dado que el mantenimiento de una superficie ocular sana depende de unidades funcionales, incluidos los párpados, las glándulas de Meibomio, el sistema lagrimal, la conjuntiva y la córnea, los modelos animales in vivo tienen algunos méritos sobre las células epiteliales de córnea cultivadas ex vivo o los tejidos corneales. En este artículo, se demuestra el modelo de ratón de la herida por abrasión corneal y el modelo de conejo de quemadura alcalina corneal.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales en estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación del Chang Gung Memorial Hospital y se adhirieron a la declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. 1. Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón Preparación de los ratonesAdministrar anestesia general a ratones C57BL/6 mediante administración intra…

Representative Results

Modelo de cicatrización de heridas ex vivo del epitelio corneal del ratón:Después del desbridamiento in vivo del epitelio corneal del ratón con removedor de anillo de óxido corneal de mano, se puede encontrar un área corneal central ligeramente deprimida con tinción positiva de fluoresceína en el área central de 2 mm (Figura 3A-B). Después de cosechar el globo ocular del ratón, se fijó fáci…

Discussion

Los modelos de ratón y conejo de lesión corneal proporcionan una plataforma útil ex vivo e in vivo para monitorear la cicatrización de heridas, probar nuevas terapias y estudiar los mecanismos subyacentes de las vías de curación y tratamiento de heridas. Se pueden utilizar diferentes modelos animales para un experimento a corto o largo plazo, dependiendo del propósito de la investigación. Por ejemplo, después de crear un defecto epitelial en la córnea de ratón in vivo, se podría usa…

Materials

6/0 Ethicon vicryl suture	Ethicon	6/0VICRYL	tarsorrhaphy
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	mouse strain
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	61763-23-3	intraperitoneal or intramuscular anesthetics
New Zealand White Rabbits	Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan		Rabbit models
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Proparacaine	Alcon	ALC2UD09	topical anesthetics
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Sodium chloride (NaOH)	Sigma-Aldrich	1310-73-2	a chemical agent for alkali burn
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004
Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL	Elanco animal health Korea Co., LTD.	047-956	intraperitoneal or intramuscular anesthetics