각막 상피의 기계적 및 화학적 손상에 대한 Ex Vivo 및 In Vivo 동물 모델
Summary
여기서는 각막 상피의 기계적 및 화학적 손상을 위해 마우스와 토끼를 기반으로 한 동물 모델을 개발하여 새로운 치료법과 기본 메커니즘을 스크리닝합니다.
Abstract
화학적 화상 및 외상을 포함한 안구 표면의 각막 손상은 심각한 흉터, symblepharon, 각막 윤부 줄기 세포 결핍을 유발할 수 있으며 크고 지속적인 각막 상피 결손을 초래할 수 있습니다. 다음과 같은 각막 혼탁 및 말초 혈관신생을 동반한 상피 결손은 돌이킬 수 없는 시각 장애를 초래하고 향후 관리, 특히 각막 성형술을 방해합니다. 동물 모델이 효과적인 약물 개발 플랫폼으로 사용될 수 있기 때문에, 마우스에 대한 각막 손상 및 토끼 각막 상피에 대한 알칼리 화상의 모델이 여기에서 개발된다. 뉴질랜드 흰 토끼는 알칼리 화상 모델에 사용됩니다. 다양한 농도의 수산화나트륨을 근육내 및 국소 마취 하에 30초 동안 각막의 중앙 원형 영역에 적용할 수 있습니다. 풍부한 등장성 생리 식염수 세척 후, 잔류 느슨한 각막 상피가 이 원형 영역 내의 Bowman’s 층 깊숙이 각막 버로 제거되었습니다. 상처 치유는 코발트 블루광 하에서 플루오레세인 염색에 의해 기록되었습니다. C57BL/6 마우스는 쥐 각막 상피의 외상성 모델에 사용되었습니다. 쥐의 중심 각막은 직경 2mm의 스킨 펀치를 사용하여 마킹한 다음 실체현미경으로 0.5mm 버가 있는 각막 녹 고리 제거제로 절제했습니다. 이러한 모델은 잠재적으로 각막 상피 재생을 촉진하는 점안액 또는 줄기 세포와 같은 혼합 제제의 치료 효과를 검증하는 데 전향적으로 사용될 수 있습니다. 실체현미경 및 이미징 소프트웨어로 각막 혼탁, 말초 혈관신생 및 결막 울혈을 관찰하여 이러한 동물 모델의 치료 효과를 모니터링할 수 있습니다.
Introduction
인간 각막은 5개의 주요 층으로 구성되어 있으며 안구 굴절에 중추적인 역할을 하여 안구 조직을 보호하기 위해 시력과 구조적 무결성을 유지합니다1. 각막의 가장 바깥쪽 부분은 각막 상피로, 기저 세포에서 순차적으로 분화하여 안구 표면에서 위쪽으로 이동하여 흘리는 5-6개의 세포층으로 구성되어 있다1. 인간 및 뉴질랜드 토끼의 각막과 비교하여, 마우스 각막은 유사한 각막 구조를 갖지만, 상피 및 간질의 감소된 두께로 인해 중심 부분보다 주변부가 더 얇다2. 안구 광학 시스템에서의 독특한 위치 때문에 기계적 손상, 박테리아 접종 및 화학 작용제와 같은 많은 외부 손상은 쉽게 상피 무결성을 위험에 빠뜨릴 수 있으며 더 나아가 시력을 위협하는 상피 결함, 감염성 각막염, 각막 용해 및 각막 천공을 유발할 수 있습니다.
윤활제, 항생제, 항염증제, 자가혈청 제품 및 양막과 같은 다양한 치료제가 이미 재상피화를 개선하고 흉터를 줄이는 데 사용되었지만 상처 치유를 가능하게 하고 염증을 줄이며 흉터 형성을 억제할 수 있는 다른 잠재적인 치료 양식은 여전히 다양한 플랫폼에서 개발 및 테스트되고 있습니다. 각막 상피 상처 치유를 위한 다양한 동물 모델이 제안되었는데, 당뇨 마우스에서 각막 녹 고리 제거제를 사용한 각막 상피 제거술3, 세균 접종을 위한 멸균 25G 바늘에 의한 마우스 각막 상피의 선형 스크래치4, 각막 녹 고리 제거제에 의한 각막 상피의 트레핀 보조 제거5, 각막과 윤부의 절반에 걸친 상피 소작6 , 무딘 메스 블레이드에 의한 트레핀 촉진 토끼 각막 찰과상7, 액체 질소8의 급속 동결에 의한 소 각막 손상.
각막 상피에 대한 기계적 손상 외에도 화학 작용제는 안구 표면, 특히 산성 및 알칼리성 작용제에 대한 일반적인 손상입니다. 수산화 나트륨 (NaOH, 30-60 초 동안 0.1-1 N)은 각막 화학 화상 9,10,11,12,13의 쥐 및 토끼 모델에서 일반적으로 사용되는 화학 물질 중 하나입니다. 100% 에탄올은 또한 쥐의 화학 화상 모델에서 각막에 적용되었고, 이어서 수술용 칼날을 사용하여 추가적인 기계적 스크랩이 이루어졌다(14). 건강한 안구 표면의 유지는 눈꺼풀, 마이봄샘, 눈물샘, 결막 및 각막을 포함한 기능 단위에 의존하기 때문에 생체 외 동물 모델은 생체 외 배양된 각막 상피 세포 또는 각막 조직에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 이 기사에서는 각막 찰과상 상처의 마우스 모델과 각막 알칼리 화상의 토끼 모델을 시연합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
각막 손상의 마우스 및 토끼 모델은 상처 치유를 모니터링하고, 새로운 치료법을 테스트하고, 상처 치유 및 치료 경로의 기본 메커니즘을 연구하기 위한 유용한 생체 외 및 생체 내 플랫폼을 제공합니다. 연구 목적에 따라 단기 또는 장기 실험에 다양한 동물 모델을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 생체 내에서 마우스 각막에 상피 결손을 생성한 후, 제한된 상피 결손을 사용하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 대만 원자력 위원회(보조금 번호 A-IE-01-03-02-02), 과학 기술부(보조금 번호 NMRPG3E6202-3) 및 Chang Gung Medical Research Project(보조금 번호 CMRPG3H1281)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| 6/0 Ethicon vicryl suture | Ethicon | 6/0VICRYL | tarsorrhaphy |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Barraquer needle holder | Katena | K6-3310 | without lock |
| Barron Vacuum Punch 8.0 mm | katena | K20-2108 | for cutting filter paper |
| C57BL/6 mice | National Laboratory Animal Center | RMRC11005 | mouse strain |
| Castroviejo forceps 0.12 mm | katena | K5-2500 | |
| Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr | Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX | CHI-675 | for debridement of the corneal epithelium |
| Filter paper | Toyo Roshi Kaisha,Ltd. | 1.11 | |
| Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 | staining for corneal epithelial defect |
| Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 61763-23-3 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
| New Zealand White Rabbits | Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan | Rabbit models | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Proparacaine | Alcon | ALC2UD09 | topical anesthetics |
| Skin biopsy punch 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Sodium chloride (NaOH) | Sigma-Aldrich | 1310-73-2 | a chemical agent for alkali burn |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA | SV11 | microscope for surgery |
| Westcott Tenotomy Scissors Medium | katena | K4-3004 | |
| Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL | Elanco animal health Korea Co., LTD. | 047-956 | intraperitoneal or intramuscular anesthetics |
References
- Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. G. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Wang, X., et al. MANF promotes diabetic corneal epithelial wound healing and nerve regeneration by attenuating hyperglycemia-induced endoplasmic reticulum stress. Diabetes. 69 (6), 1264-1278 (2020).
- Ma, X., et al. Corneal epithelial injury-induced norepinephrine promotes Pseudomonas aeruginosa keratitis. Experimental Eye Research. 195, 108048 (2020).
- Chan, M. F., Werb, Z. Animal models of corneal injury. Bio Protocol. 5 (13), 1516 (2015).
- Lan, Y., et al. Kinetics and function of mesenchymal stem cells in corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3638-3644 (2012).
- Watanabe, M., et al. Promotion of corneal epithelial wound healing in vitro and in vivo by annexin A5. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1862-1868 (2006).
- Murataeva, N., et al. Cannabinoid CB2R receptors are upregulated with corneal injury and regulate the course of corneal wound healing. Experimental Eye Research. 182, 74-84 (2019).
- Carter, K., et al. Characterizing the impact of 2D and 3D culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomaterialia. 99, 247-257 (2019).
- Sanie-Jahromi, F., et al. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model. Bioimpacts. 10 (1), 45-54 (2020).
- Sun, M. M., et al. Epithelial membrane protein (EMP2) antibody blockade reduces corneal neovascularization in an In vivo model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (1), 245-254 (2019).
- Yang, Y., et al. Cannabinoid receptor 1 suppresses transient receptor potential vanilloid 1-induced inflammatory responses to corneal injury. Cell Signal. 25 (2), 501-511 (2013).
- Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Oh, J. Y., et al. Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16875 (2010).
- Wang, T., et al. Evaluation of the effects of biohcly in an in vivo model of mechanical wounds in the rabbit cornea. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 35 (3), 189-199 (2019).
- Gong, Y., et al. Effect of nintedanib thermos-sensitive hydrogel on neovascularization in alkali burn rat model. International Journal of Ophthalmology. 13 (6), 879-885 (2020).
- Yao, L., et al. Role of mesenchymal stem cells on cornea wound healing induced by alkali burn. PLoS One. 7 (2), 30842 (2012).
