מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

Summary

כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.

Abstract

פגיעה בקרנית בפני השטח של העין, כולל כוויה כימית וטראומה, עלולה לגרום לצלקות קשות, סימפלפרון, מחסור בתאי גזע לימבליים בקרנית, ולגרום לפגם אפיתל גדול ומתמשך בקרנית. פגם אפיתל עם אטימות הקרנית הבאה וניאו-וסקולריזציה היקפית גורמים לליקוי ראייה בלתי הפיך ומעכבים ניהול עתידי, במיוחד קרטופלסטיקה. מכיוון שהמודל החייתי יכול לשמש כפלטפורמה יעילה לפיתוח תרופות, מפותחים כאן מודלים של פגיעה בקרנית העכבר וצריבה אלקלית לאפיתל קרנית ארנבת. ארנב לבן ניו זילנדי משמש במודל הכוויה האלקלי. ריכוזים שונים של נתרן הידרוקסידי יכולים להיות מיושמים על האזור המעגלי המרכזי של הקרנית במשך 30 שניות תחת הרדמה תוך שרירית ומקומית. לאחר השקיה איזוטונית תקינה של מי מלח, הוסר אפיתל קרנית רופף שאריות עם בור הקרנית עמוק עד לשכבת באומן בתוך אזור מעגלי זה. ריפוי פצעים תועד על ידי כתמים פלואורסצאין תחת אור כחול קובלט. עכברי C57BL/6 שימשו במודל הטראומטי של אפיתל קרנית מורין. הקרנית המרכזית של המורין סומנה באמצעות ניקוב עור, בקוטר 2 מ”מ, ולאחר מכן פוזרה על ידי מסיר טבעת חלודה בקרנית עם בור 0.5 מ”מ תחת סטריאוסקופ. מודלים אלה יכולים לשמש באופן פרוספקטיבי כדי לאמת את ההשפעה הטיפולית של טיפות עיניים או סוכנים מעורבים כגון תאי גזע, אשר עשויים להקל על התחדשות אפיתל הקרנית. על ידי התבוננות באטימות הקרנית, ניאו-וסקולריזציה היקפית וגודש בלחמית באמצעות סטריאומיקרוסקופ ותוכנות הדמיה, ניתן לנטר השפעות טיפוליות במודלים אלה של בעלי חיים.

Introduction

הקרנית האנושית מורכבת מחמש שכבות עיקריות וממלאת תפקיד מרכזי בשבירת העין לשמירה על חדות הראייה והשלמות המבנית להגנה על רקמות תוך עיניות¹. החלק החיצוני ביותר של הקרנית הוא אפיתל הקרנית, המורכב מחמש עד שש שכבות של תאים המתמיינים ברצף מתאי הבסיס ונעים כלפי מעלה כדי לנשור מפני השטח של העין¹. בהשוואה לקרנית בבני אדם ובארנבים ניו זילנדיים, לקרנית העכבר מבנה קרנית דומה, אך פריפריה דקה יותר מהחלק המרכזי בשל עובי מופחת באפיתל ובסטרומה². בגלל מיקומו הייחודי במערכת האופטית העינית, עלבונות חיצוניים רבים כגון פגיעה מכנית, חיסון חיידקי וחומרים כימיים עלולים לסכן בקלות את שלמות האפיתל ולהוביל עוד יותר לפגם אפיתל מסכן ראייה, קרטיטיס זיהומיות, המסת קרנית ואפילו ניקוב הקרנית.

למרות שחומרים טיפוליים שונים, כגון חומרי סיכה, אנטיביוטיקה, חומרים אנטי דלקתיים, מוצרי אוטו-סרום וקרומי מי שפיר כבר שימשו לשיפור אפיתל מחדש ולהפחתת צלקות, שיטות טיפול פוטנציאליות אחרות שיכולות לאפשר ריפוי פצעים, להפחית דלקת ולדכא היווצרות צלקות עדיין מפותחות ונבחנות על פלטפורמות שונות. הוצעו מודלים שונים של בעלי חיים לריפוי פצעי אפיתל בקרנית, ביניהם הסרת אפיתל קרנית באמצעות מסיר טבעות חלודה בקרנית בעכבר סוכרתי³, שריטות ליניאריות מעל אפיתל הקרנית של עכבר על ידי מחט סטרילית 25 גרם לחיסון חיידקי⁴, הסרה בעזרת טרפין של אפיתל הקרנית על ידי מסיר טבעת חלודה בקרנית⁵, צריבה אפיתל מעל מחצית הקרנית ולימבוס⁶ שחיקת קרנית ארנב בסיוע טרפין על ידי להב אזמל עמום⁷, ופגיעה בקרנית בקר על ידי הקפאת הבזק בחנקן נוזלי⁸.,

מלבד פגיעה מכנית באפיתל הקרנית, חומרים כימיים הם גם עלבונות נפוצים בפני השטח של העין, במיוחד חומרים חומציים ואלקליים. נתרן הידרוקסידי (NaOH, 0.1-1 N עבור 30-60 שניות) הוא אחד הכימיקלים הנפוצים במודלים של מורין וארנב של כוויות כימיות בקרנית 9,10,11,12,13. 100% אתנול הוחל גם על הקרנית במודל הכוויה הכימית של חולדה, ולאחר מכן גריטה מכנית נוספת באמצעות להב כירורגי¹⁴. מכיוון ששמירה על משטח עיני בריא מסתמכת על יחידות תפקודיות, כולל העפעפיים, בלוטות המייבומיאן, מערכת הדמעות, הלחמית והקרנית, למודלים של בעלי חיים in vivo יש כמה יתרונות על פני תאי אפיתל של הקרנית בתרבית ex vivo או רקמות הקרנית. במאמר זה, מודל העכבר של פצע שחיקה הקרנית, ואת מודל ארנב של כוויה אלקלית הקרנית מודגמים.

Protocol

כל הליכי הניסוי במחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של המחקר בבית החולים לזכר צ’אנג גונג ודבקו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. 1. מודל ריפוי פצע Ex vivo של אפיתל הקרנית של העכבר הכנת העכבריםמתן הרדמה כללית לעכברי C57BL/6 על ידי אספקה …

Representative Results

מודל ריפוי פצעים Ex vivo של אפיתל הקרנית של העכבר:לאחר הטריה in vivo של אפיתל הקרנית של עכבר עם מסיר טבעת חלודה קרנית ידני, ניתן למצוא אזור קרנית מרכזי מדוכא קלות עם כתם פלואורסצאין חיובי באזור המרכזי של 2 מ”מ (איור 3A-B). לאחר קצירת גל…

Discussion

מודלים של עכברים וארנבים של פגיעות בקרנית מספקים פלטפורמה שימושית של ex vivo ו-in vivo למעקב אחר ריפוי פצעים, בדיקת טיפולים חדשים ולימוד מנגנונים בסיסיים של ריפוי פצעים ומסלולי טיפול. מודלים שונים של בעלי חיים יכולים לשמש לניסוי לטווח קצר או ארוך, בהתאם למטרת המחקר. לדוגמה, לאחר יצירת פ…

Materials

6/0 Ethicon vicryl suture	Ethicon	6/0VICRYL	tarsorrhaphy
Barraquer lid speculum	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer needle holder	Katena	K6-3310	without lock
Barron Vacuum Punch 8.0 mm	katena	K20-2108	for cutting filter paper
C57BL/6 mice	National Laboratory Animal Center	RMRC11005	mouse strain
Castroviejo forceps 0.12 mm	katena	K5-2500
Corneal rust ring remover with 0.5 mm burr	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	for debridement of the corneal epithelium
Filter paper	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
Fluorescein sodum ophthalmic strips U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	staining for corneal epithelial defect
Ketamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	61763-23-3	intraperitoneal or intramuscular anesthetics
New Zealand White Rabbits	Livestock Research Institute, Council of Agriculture,Executive Yuan		Rabbit models
Normal saline	TAIWAN BIOTECH CO., LTD.	100-120-1101
Proparacaine	Alcon	ALC2UD09	topical anesthetics
Skin biopsy punch 2mm	STIEFEL	22650
Sodium chloride (NaOH)	Sigma-Aldrich	1310-73-2	a chemical agent for alkali burn
Stereomicroscope	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	microscope for surgery
Westcott Tenotomy Scissors Medium	katena	K4-3004
Xylazine hydrochloride 23.32 mg/10 mL	Elanco animal health Korea Co., LTD.	047-956	intraperitoneal or intramuscular anesthetics