Desarrollamos un protocolo práctico y un enfoque analítico para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial y la capacidad de transferencia de electrones en homogeneizados tumorales frescos. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar varias funciones mitocondriales que contribuyen al inicio, la progresión y la respuesta al tratamiento del cáncer.
Las mitocondrias son esenciales para la aparición y progresión del cáncer a través de la producción de energía, la regulación reactiva de especies de oxígeno y la síntesis de macromoléculas. Las adaptaciones genéticas y funcionales de las mitocondrias al entorno tumoral impulsan el potencial proliferativo y metastásico. El advenimiento de la secuenciación de ADN y ARN eliminó las barreras críticas para la evaluación de los mediadores genéticos de la tumorigénesis. Sin embargo, hasta la fecha, los enfoques metodológicos para evaluar la función mitocondrial tumoral siguen siendo difíciles de alcanzar y requieren una competencia técnica que limite la viabilidad, lo que en última instancia disminuye el valor diagnóstico y pronóstico tanto en entornos experimentales como clínicos. Aquí, describimos un método simple y rápido para cuantificar las tasas de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la capacidad de transferencia de electrones (ET) en homogeneizados de tumores sólidos recién extirpados utilizando respirometría de alta resolución. El protocolo puede aplicarse de forma reproducible entre especies y tipos de tumores, así como adaptarse para evaluar una diversidad de vías ET mitocondriales. Usando este protocolo, demostramos que los ratones portadores de un cáncer de mama luminal B exhiben una respiración defectuosa ligada a nicotinamida adenina dinucleótido y dependencia del succinato para generar trifosfato de adenosina a través de OXPHOS.
Todas las células están íntimamente unidas por su necesidad de producir y consumir trifosfato de adenosina (ATP), la moneda de energía molecular. A medida que las mutaciones celulares dan lugar a la formación de tumores, las mitocondrias aseguran la supervivencia a través de la diversificación de la producción de energía que a menudo es fenotípicamente distinguible del tejido no canceroso1,2,3. Como tal, existe una necesidad crítica de un perfil rápido y profundo de la función respiratoria mitocondrial para facilitar la clasificación del tipo de tumor, el inicio del cáncer, la progresión y la respuesta al tratamiento.
Las funciones respiratorias de las muestras de tejido extirpado no se pueden evaluar intactas ya que los sustratos primarios para OXPHOS no son permeables a las células. Para superar esta limitación, las mitocondrias se pueden preparar mediante aislamiento, permeabilización química u homogeneización mecánica. El aislamiento mitocondrial se considera durante mucho tiempo como un estándar de oro para la evaluación de la función respiratoria. Sin embargo, requiere grandes cantidades de tejido, consume mucho tiempo y es de bajo rendimiento con posible sesgo de selección para ciertas fracciones de mitocondrias4. La permeabilización consiste en la separación mecánica y la exposición de secciones de tejido o haces de fibra a un detergente suave que degrada selectivamente la membrana plasmática5. La permeabilización se emplea con frecuencia en tejidos estriados como el músculo esquelético y cardíaco, ya que los haces de fibra individuales se pueden separar. En comparación con el aislamiento, la permeabilización produce más mitocondrias en su entorno celular nativo y forma física5. La permeabilización se ha aplicado con éxito en otros tejidos como el tumor6,7 y la placenta8; sin embargo, la reproducibilidad de las preparaciones de fibra permeabilizada puede ser difícil debido a la consistencia de la disección y los requisitos de oxígeno para superar las limitaciones de difusión9. Además, las fibras permeabilizadas pueden ser inadecuadas en ciertos tipos de tumores que son densamente celulares y altamente fibróticos. Los homogeneizados tisulares se generan a través de la interrupción mecánica de la membrana plasmática y son similares a las fibras permeabilizadas en términos de rendimiento e integridad mitocondrial10. Los homogeneizados tisulares también minimizan las limitaciones de la difusión de oxígeno y se pueden emplear fácilmente en todos los tipos de tejidos a través de la optimización de la fuerza mecánica11,12.
Aquí, describimos un método simple y rápido para cuantificar las tasas de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la capacidad de transferencia de electrones (ET) en homogeneizados de tumores sólidos recién extirpados. El protocolo está diseñado de manera óptima para evaluar el tejido fresco utilizando el respirómetro de alta resolución Oxygraph-2k (O2k), que requiere conocimientos previos de configuración y calibración instrumental, pero se puede adaptar de manera similar utilizando cualquier electrodo de tipo Clark, analizador Seahorse o lector de placas. El protocolo puede aplicarse de forma reproducible entre especies y tipos de tumores, así como adaptarse para evaluar una diversidad de vías ET mitocondriales.
Los enfoques para evaluar la respiración mitocondrial en el cáncer se han limitado en gran medida a los modelos in vitro 13,14,15,16. Se ha logrado cierto éxito en la medición de la respiración mitocondrial en tumores utilizando la permeabilización química6,7,17,pero no existe un enfoque uniforme y estándar de oro que pueda aplicarse universalmente y compararse entre tipos de tumores. Además, la falta de análisis e informes de datos consistentes ha limitado la generalización y reproducibilidad de los datos. El método descrito en este documento proporciona un enfoque simple y relativamente rápido para medir la respiración mitocondrial18 en preparaciones mitocondriales a partir de muestras de tumores sólidos recién extirpados. Los tumores se cultivaron a partir de células de cáncer de mama mamario Luminal B murinas implantadas ortotópicamente B, ERα-negativas EO77119.
La diligencia y el cuidado con el manejo de tejidos mejorarán en gran medida la precisión y la normalización de las tasas de consumo de oxígeno. El tejido y las mitocondrias pueden dañarse fácilmente si la muestra no se mantiene fría, no se sumerge constantemente en medios de preservación o se manipula en exceso, lo que resulta en tasas de rutina y OXPHOS subóptimas. Además, el peso húmedo preciso del tejido homogeneizado es de importancia crítica, ya que este es el método de normalización primario. Se pueden considerar otros métodos de normalización, como la proteína total o los marcadores específicos mitocondriales, como la actividad de la citrato sintasa20. Además, será necesario abordar la heterogeneidad tisular, con decisiones sobre las regiones tumorales para incluir en los experimentos realizados a priori. El tejido necrótico, fibrótico y conectivo puede no homogeneizarse y / o respirar bien y debe evitarse a menos que se analicen intencionalmente estas regiones tumorales. En particular, el tumor puede ser muy pegajoso dependiendo del tipo y la región de escisión, lo que hace que el pesaje y la transferencia precisos sean más difíciles. El número de accidentes cerebrovasculares utilizados para las homogeneizaciones debe optimizarse para garantizar la preparación completa de las mitocondrias al tiempo que mitiga el daño a las membranas mitocondriales externas.
Para mejorar la precisión y la reproducibilidad, recomendamos que se realicen experimentos de optimización para el número de accidentes cerebrovasculares para la preparación homogeneizada, la concentración de tejido y las concentraciones de sustrato, desacoplador e inhibidor. Los estudios pueden comparar el diferente número de accidentes cerebrovasculares y cómo se corresponden con la respuesta a la adición de citocromo c dentro del estudio, así como la capacidad respiratoria mitocondrial máxima 21. Aunque existe una aceptación general de que una menor respuesta del citocromo c es mejor, ya que un aumento en el consumo de oxígeno después de la adición del citocromo c puede indicar daño a la membrana mitocondrial externa, no existe un estándar de oro en cuanto a cuál es este umbral para cada tejido y debe investigarse experimentalmente para garantizar que el tejido no esté sobrecargado de trabajo o poco preparado. En este tejido tumoral, se encontró que una respuesta del citocromo c por debajo de ~ 30% no afectó la función respiratoria. El uso del citocromo c se vuelve crítico para la cuantificación precisa de la capacidad respiratoria si la prueba es positiva. En este caso, la adición repone el citocromo c endógeno, que, si se agota, causará una subestimación de las frecuencias respiratorias.
Los experimentos de titulación de la concentración tisular se pueden realizar en un rango de concentraciones factibles e, idealmente, se realizarían con IED que se investigarán durante el estudio. La capacidad respiratoria variará según el tipo de tumor y la composición. Por lo tanto, los tumores densos con mitocondrias o alta capacidad respiratoria requerirán concentraciones más bajas (0.5-5 mg / ml). Los tumores con pocas mitocondrias o baja capacidad respiratoria requerirán concentraciones más altas (7-12 mg/ml). Además, los IED que son largos o tienen sustratos muy consumidos pueden necesitar menos tejido para evitar la reoxigenación de la cámara o la limitación de ADP. Algunos tejidos tendrán una relación lineal en el consumo de oxígeno, mientras que otros mostrarán una sensibilidad mejorada y una oxidación máxima en ciertos rangos de concentración. La concentración de tejido elegida debe optimizarse para maximizar el flujo de oxígeno al tiempo que se limita el número de eventos de reoxigenación. Además, a menudo es mejor sobreestimar la necesidad o apuntar al extremo superior del rango de concentración. Los inhibidores, que son esenciales para la cuantificación de los flujos respiratorios, son más precisos cuando se usan en grupos más grandes de mitocondrias.
Otra consideración esencial es la concentración de los medicamentos que se utilizan durante los protocolos. Los cambios en la concentración de homogeneizados pueden alterar las concentraciones de sustratos, desacopladores e inhibidores necesarios para la respuesta máxima. Por lo tanto, una vez que se elige el rango de concentración óptimo, se debe realizar un experimento que pruebe las dosis requeridas para el protocolo SUIT. Se puede agregar ADP adicional para garantizar que las concentraciones de adenilato no se limiten a los flujos respiratorios. Los desacopladores químicos como FCCP o CCCP inhibirán la respiración a concentraciones más altas22. Como tal, es esencial valorar en pequeñas cantidades para revelar la tasa máxima alcanzada. Los inhibidores, como la rotenona y la antimicina A, se usan mejor cuando están saturados dentro de la primera inyección. Si bien las concentraciones óptimas se determinaron en experimentos preliminares, también hemos observado diferencias relacionadas con el tratamiento en la respuesta a los inhibidores y, por lo tanto, a menudo agregamos una inyección adicional de inhibidores para demostrar la inhibición máxima, ya que las tasas resultantes sirven como base para la cuantificación. La inhibición química de Ascorbato/TPMD es esencial para una reducción analítica precisa ya que TMPD sufre autooxidación23. Controlamos la autooxidación de ascorbato/TMPD/citocromo c mediante la adición de azida de sodio, un inhibidor de CIV establecido. Para los estudios Km, la adición de rotenona en presencia de succinato solo previene la acumulación de oxaloacetato que puede inhibir la actividad de la succinato deshidrogenasa a bajas concentraciones24. El volumen y la concentración de ADP dependen en gran medida de la sensibilidad de las mitocondrias a la combinación de sustrato prevaleciente. Las preparaciones mitocondriales que son altamente sensibles a ADP requerirán concentraciones iniciales más bajas. Además, los productos químicos validados y la preparación adecuada de medicamentos con atención al pH, la sensibilidad a la luz si corresponde y la temperatura de almacenamiento son esenciales para experimentos exitosos.
La configuración del instrumento y el cuidado de rutina son de importancia crítica para el éxito de estos experimentos. La limpieza adecuada y adecuada de las cámaras es esencial para la reproducibilidad y la prevención de la contaminación biológica, proteica, inhibidora o no del desacoplador. Los electrodos de tipo Clark y los sistemas O2k utilizan cámaras de reacción de vidrio, lo que es una ventaja de costo significativa para los sistemas basados en placas que dependen de consumibles. Sin embargo, las cámaras de vidrio deben limpiarse vigorosamente y pueden ser una fuente de contaminación por inhibidores en estudios posteriores. La incubación con especímenes ricos en mitocondrias durante el proceso de lavado (mitocondrias aisladas del corazón o del hígado, por ejemplo) puede reducir el riesgo de contaminación experimental y se recomienda además de los procedimientos de dilución y lavado a base de alcohol. Si se realizan estudios consecutivos, la limpieza con etanol y mitocondrias minimiza la posibilidad de contaminación por inhibidores. Se recomienda la calibración del sensor de oxígeno antes de cada experimento para obtener mediciones precisas de la respiración en relación con la presión parcial prevaleciente de oxígeno. Si no son factibles múltiples calibraciones, una calibración al día puede ser suficiente si la concentración de oxígeno permanece estable y consistente después del procedimiento de lavado.
Los procedimientos descritos anteriormente aprovechan el instrumento Oroboros O2k para medir el consumo de oxígeno en el tejido tumoral dentro de las 4 horas posteriores a la escisión del tumor utilizando una solución de preservación previamente diseñada y optimizada y medios de respiración25,26,27. Se pueden modificar varios parámetros de este protocolo para aplicaciones posteriores. La configuración y calibración del instrumento, los homogeneizadores utilizados para la preparación de tejidos y la concentración óptima de homogeneizado y oxígeno de cámara se pueden adaptar para su uso en otros instrumentos con potencial de monitoreo de oxígeno. Por ejemplo, las cámaras estaban ligeramente sobrecargadas al agregar homogeneizado, y por lo tanto, cuando la cámara está completamente cerrada, el capilar de la cámara permanece lleno. Esto consumirá algo de oxígeno en la cámara, pero con la optimización de la concentración de la muestra, podemos tener en cuenta este consumo para determinar con qué nivel de oxígeno comenzar. Alternativamente, se puede permitir que la muestra se equilibre con el oxígeno ambiental antes de que se cierre la cámara, pero esto a menudo aumentará la cantidad de tiempo antes de que comience el experimento y retrasará la adición de sustratos. Si bien los homogeneizadores utilizados en este protocolo son ampliamente accesibles, se podrían emplear otras técnicas comerciales de homogeneización, como una trituradora de tejidos u homogeneizador automatizado28.
Además, la preparación de tejidos y los procedimientos de instrumentos se pueden utilizar con una serie de DIFERENTES IGIT para estudiar el control respiratorio mediante una diversidad de estados de acoplamiento y control devías 29. Estos protocolos SUIT han sido desarrollados para medir la capacidad funcional, y por lo tanto, la contribución de sustratos endógenos potenciales no tiene ningún impacto en la medición de la capacidad. Analíticamente contabilizamos el consumo de oxígeno no mitocondrial y/o el consumo residual del homogeneizado mediante la sustracción de la antimicina A-rotenona, o las tasas insensibles a la azida de sodio, según corresponda. Las mitocondrias pueden permanecer viables en BIOPS o soluciones de preservación construidas de manera similar durante largos períodos de tiempo (>24 h) dependiendo del tipo de tejido y la integridad30,31. Se pueden realizar estudios por adelantado para determinar los límites de almacenamiento temporal, ya que OXPHOS de ciertos sustratos puede tener diferentes limitaciones. Esto es esencial si el experimento no se puede realizar dentro de varias horas de la escisión / biopsia de tejido. 37 ° C es una temperatura óptima y fisiológica para la evaluación de la función respiratoria en la mayoría de los sistemas de mamíferos. Sin embargo, si la temperatura del ensayo parece interferir con la evaluación32,se pueden realizar estudios comparativos en un amplio rango de temperaturas (25-40 °C) para garantizar una capacidad de respuesta adecuada. Las restricciones instrumentales pueden limitar la capacidad de realizar tales estudios.
Las principales limitaciones del método descrito anteriormente son 1) el potencial de daño a las mitocondrias a través de la homogeneización mecánica, 2) la presencia de ATPasas u otros bioquímicos subcelulares en preparaciones homogeneizadas que pueden interferir con la determinación simultánea de ATP u otras variables de interés y pueden requerir métodos de corrección adicionales o el uso de inhibidores33 , y 3) la evaluación de muchas muestras y/o múltiples IGIT por muestra requiere mucho tiempo, ya que un instrumento puede acomodar dos experimentos a la vez y requiere limpieza y configuración entre experimentos sucesivos. Los experimentos de optimización y la preparación consistente de muestras pueden minimizar el daño mitocondrial sustancial que contribuiría a datos inconsistentes.
La importancia del método con respecto a los métodos existentes / alternativos es una mejor viabilidad en comparación con la cantidad de material de partida, el desafío de aislar las mitocondrias o el desafío técnico en el tejido permeabilizante. La preparación de homogeneizados es más rápida, el oxígeno no es tan limitante y es menos susceptible a la variabilidad entre el personal en comparación con el tejido permeabilizado. Es importante destacar que casi todos los tipos de muestra son adecuados para la preparación homogeneizada, lo que permite un análisis comparativo entre los tejidos. La respirometría de alta resolución es la medición estándar de oro de OXPHOS mitocondrial y ET. La aplicación de este método en la investigación preclínica y clínica del cáncer tiene la capacidad de ampliar las investigaciones in vitro actuales a estudios ex vivo. Además, ofrece aplicaciones potenciales en entornos clínicos y de diagnóstico.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al personal central de biología comparativa del Centro de Investigación Biomédica de Pennington por el cuidado de los animales. Esta investigación fue apoyada en parte por las subvenciones del Instituto Nacional de Salud U54GM104940 (JPK) y KL2TR003097 (LAG). Todos los experimentos y procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Investigación Biomédica de Pennington.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free | Sigma-Aldrich | 3117057001 | Roche |
BD 50 mL Luer-Lok Syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Datlab 7.4 software | Oroboros Instruments | ||
Dimethylsulfoxide | Amresco | N182 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumoxel, autoclavable |
Dumont # 7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumoxel, autoclavable |
Digital Calipers 150 mm/6 in | World Precision Instruments | 501601 | |
EO771 cells | CH3 BioSystems | SKU: 94APV1-vial-prem | Pathogen Tested |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock #000664 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 34120 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | L2398 | |
Malate | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
MgCl·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Microsyringes | Hamilton | 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | |
Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10023-03 | |
Oxygraph-2k FluoRespirometer | Oroboros Instruments | 10003-01 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875034 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Succinate (disodium) | Sigma-Aldrich | W327700 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Whatman Filter Paper, grade 5 | Sigma-Aldrich | 1005-090 | |
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL | Duran Wheaton Kimble | 357424 | |
Straight Tip Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5914SC | |
Non-Safety Scalpel No. 11 | McKesson | 1029065 | |
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 | Becton, Dickinson and Company | 305109 | |
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 | Becton, Dickinson and Company | 305195 | |
BD 1mL Slip Tip Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 316060 | |
Rodent Very High Fat Diet, 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate | Research Diet | D12492 | |
Pyrex Watch Glass, 100 mm | Thermo Fisher Scientific | S34819 |