Wir entwickelten ein praktisches Protokoll und einen analytischen Ansatz zur Bewertung der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung und Der Elektronentransferkapazität in frischen Tumorhomogenaten. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Funktionen zu überwachen, die zur Entstehung, Progression und Ansprechen auf die Behandlung von Krebs beitragen.
Mitochondrien sind essentiell für den Ausbruch und das Fortschreiten von Krebs durch Energieproduktion, reaktive Sauerstoffspeziesregulation und Makromolekülsynthese. Genetische und funktionelle Anpassungen der Mitochondrien an die Tumorumgebung treiben das proliferative und metastatische Potenzial voran. Das Aufkommen der DNA- und RNA-Sequenzierung beseitigte kritische Barrieren für die Bewertung genetischer Mediatoren der Tumorgenese. Bis heute sind methodische Ansätze zur Bewertung der mitochondrialen Funktion von Tumoren jedoch schwer fassbar und erfordern technische Fähigkeiten, die die Machbarkeit einschränken und letztendlich den diagnostischen und prognostischen Wert sowohl im experimentellen als auch im klinischen Umfeld verringern. Hier skizzieren wir eine einfache und schnelle Methode zur Quantifizierung der Raten der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) und Elektronentransferkapazität (ET) in frisch ausgeschnittenen soliden Tumorhomogenaten mittels hochauflösender Respirometrie. Das Protokoll kann reproduzierbar über Spezies und Tumorarten hinweg angewendet sowie angepasst werden, um eine Vielzahl von mitochondrialen ET-Signalwegen zu bewerten. Mit diesem Protokoll zeigen wir, dass Mäuse, die einen luminalen B-Brustkrebs tragen, eine defekte Nicotinamidadenindinukleotid-gebundene Atmung aufweisen und auf Succinat angewiesen sind, um Adenosintriphosphat über OXPHOS zu erzeugen.
Alle Zellen sind eng miteinander verbunden durch ihre Notwendigkeit, Adenosintriphosphat (ATP), die molekulare Energiewährung, zu produzieren und zu konsumieren. Da zelluläre Mutationen zur Bildung von Tumoren führen, sichern Mitochondrien das Überleben durch Diversifizierung der Energieproduktion, die oft phänotypisch von nicht-krebsartigem Gewebe unterscheidbar ist1,2,3. Daher besteht ein kritischer Bedarf an einer schnellen und tiefen Profilierung der mitochondrialen Atmungsfunktion, um die Klassifizierung von Tumortyp, Krebsbeginn, Progression und Behandlungsreaktion zu erleichtern.
Die Atmungsfunktionen von exzidierten Gewebeproben können nicht intakt bewertet werden, da die primären Substrate für OXPHOS nicht zelldurchlässig sind. Um diese Einschränkung zu überwinden, können Mitochondrien entweder durch Isolierung, chemische Permeabilisierung oder mechanische Homogenisierung hergestellt werden. Die mitochondriale Isolierung gilt seit langem als Goldstandard für die Beurteilung der Atmungsfunktion. Es erfordert jedoch große Mengen an Gewebe, ist zeitaufwendig und ist gering ertragreich mit möglicher Selektionsverzerrung für bestimmte Fraktionen der Mitochondrien4. Die Permeabilisierung besteht aus der mechanischen Trennung und Der Exposition von Gewebeschnitten oder Faserbündeln gegenüber einem milden Reinigungsmittel, das die Plasmamembran selektiv abbaut5. Die Permeabilisierung wird häufig in quergestreiften Geweben wie Skelett- und Herzmuskel eingesetzt, da einzelne Faserbündel auseinander gezogen werden können. Im Vergleich zur Isolation ergibt die Permeabilisierung mehr Mitochondrien in ihrer nativen zellulären Umgebung und physischen Form5. Die Permeabilisierung wurde erfolgreich in anderen Geweben wie Tumor6,7 und Plazenta8angewendet ; Die Reproduzierbarkeit von permeabilisierten Faserpräparaten kann jedoch aufgrund der Konsistenz der Dissektion und des Sauerstoffbedarfs zur Überwindung von Diffusionsbeschränkungen schwierig sein9. Darüber hinaus können permeabilisierte Fasern bei bestimmten Tumorarten, die dichtzellig und stark fibrotisch sind, ungeeignet sein. Gewebehomogenate entstehen durch mechanische Störung der Plasmamembran und ähneln permeabilisierten Fasern in Bezug auf mitochondriale Ausbeute und Integrität10. Gewebehomogenate minimieren auch die Einschränkungen der Sauerstoffdiffusion und können durch Optimierung der mechanischen Kraft11,12leicht gewebeübergreifend eingesetzt werden.
Hier skizzieren wir eine einfache und schnelle Methode zur Quantifizierung der Raten der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) und Elektronentransferkapazität (ET) in frisch ausgeschnittenen soliden Tumorhomogenaten. Das Protokoll ist optimal für die Bewertung von frischem Gewebe mit dem hochauflösenden Oxygraph-2k (O2k)-Respirometer ausgelegt, das Vorkenntnisse in der instrumentellen Einrichtung und Kalibrierung erfordert, aber in ähnlicher Weise mit jeder Clark-Elektrode, jedem Seepferdchen-Analysator oder Plattenleser angepasst werden kann. Das Protokoll kann reproduzierbar über Spezies und Tumorarten hinweg angewendet sowie angepasst werden, um eine Vielzahl von mitochondrialen ET-Signalwegen zu bewerten.
Ansätze zur Bewertung der mitochondrialen Atmung bei Krebs waren weitgehend auf die In-vitro-Modelle 13,14,15,16beschränkt. Einige Erfolge wurden bei der Messung der mitochondrialen Atmung in Tumoren mittels chemischer Permeabilisierung6,7,17erzielt, aber es gibt keinen einheitlichen Goldstandardansatz, der universell angewendet und über Tumorarten hinweg verglichen werden kann. Darüber hinaus hat das Fehlen einer konsistenten Datenanalyse und Berichterstattung die Generalisierbarkeit und Reproduzierbarkeit der Daten eingeschränkt. Die hier beschriebene Methode bietet einen einfachen, relativ schnellen Ansatz zur Messung der mitochondrialen Atmung18 in mitochondrialen Präparaten aus frisch ausgeschnittenen soliden Tumorproben. Tumore wurden aus orthotopisch implantierten murinen Luminal B, ERα-negativen EO771 Brustkrebszellengezüchtet 19.
Sorgfalt und Sorgfalt bei der Gewebehandhabung werden die Genauigkeit und Normalisierung der Sauerstoffverbrauchsraten erheblich verbessern. Das Gewebe und die Mitochondrien können leicht beschädigt werden, wenn die Probe nicht kalt gehalten wird, nicht konsequent in Konservierungsmedien eingetaucht wird oder übermäßig gehandhabt wird, was zu suboptimalen Routine- und OXPHOS-Raten führt. Darüber hinaus ist das genaue Nassgewicht des homogenisierten Gewebes von entscheidender Bedeutung, da dies die primäre Normalisierungsmethode ist. Andere Normalisierungsmethoden können in Betracht gezogen werden, wie z.B. Gesamtprotein oder mitochondriale spezifische Marker, wie die Citratsynthase-Aktivität20. Darüber hinaus muss die Heterogenität des Gewebes angegangen werden, wobei Entscheidungen über Tumorregionen in Experimente einbezogen werden sollen, die a priori getroffen werden. Nekrotisches, fibrotisches und Bindegewebe homogenisiert und / oder atmet nicht gut und sollte vermieden werden, es sei denn, diese Tumorregionen werden absichtlich untersucht. Insbesondere kann der Tumor je nach Art und Exzisionsregion sehr klebrig sein, was das genaue Wiegen und Übertragen schwieriger macht. Die Anzahl der Schläge, die für Homogenisierungen verwendet werden, sollte optimiert werden, um eine vollständige Vorbereitung der Mitochondrien zu gewährleisten und gleichzeitig die Schädigung der äußeren mitochondrialen Membranen zu mildern.
Für eine verbesserte Genauigkeit und Reproduzierbarkeit empfehlen wir die Durchführung von Optimierungsexperimenten für die Anzahl der Schläge für die Homogenatpräparation, die Gewebekonzentration und die Konzentrationen von Substrat, Entkoppler und Inhibitoren. Studien können die unterschiedliche Anzahl von Schlaganfällen vergleichen und wie sie mit der Reaktion auf die Zugabe von Cytochrom c innerhalb der Studie sowie der maximalen mitochondrialen Atmungskapazität korrespondieren 21. Obwohl allgemein anerkannt ist, dass eine geringere Cytochrom-c-Reaktion besser ist, da eine Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs nach Zugabe von Cytochrom c auf eine Schädigung der äußeren mitochondrialen Membran hinweisen kann, gibt es keinen Goldstandard, was dieser Schwellenwert für jedes Gewebe ist, und sollte experimentell untersucht werden, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht überarbeitet oder untervorbereitet wird. In diesem Tumorgewebe wurde festgestellt, dass eine Cytochrom-c-Reaktion unter ~ 30% die Atmungsfunktion nicht beeinträchtigte. Die Verwendung von Cytochrom c wird entscheidend für die genaue Quantifizierung der Atmungskapazität, wenn der Test positiv ist. In diesem Fall füllt die Zugabe das endogene Cytochrom c auf, das, wenn es erschöpft ist, eine Unterschätzung der Atemfrequenzen verursacht.
Gewebekonzentrationstitrationsexperimente können über eine Reihe von machbaren Konzentrationen durchgeführt werden und würden idealerweise mit SUITs durchgeführt, die während der Studie untersucht werden. Die Atmungskapazität variiert je nach Tumortyp und -zusammensetzung. Daher erfordern Tumore, die mit Mitochondrien oder hoher Atmungskapazität dicht sind, niedrigere Konzentrationen (0,5-5 mg / ml). Tumore mit wenigen Mitochondrien oder geringer Atmungskapazität erfordern höhere Konzentrationen (7-12 mg / ml). Darüber hinaus benötigen SUITs, die lang sind oder stark verbrauchte Substrate aufweisen, möglicherweise weniger Gewebe, um eine Reoxygenierung der Kammer oder eine ADP-Begrenzung zu verhindern. Einige Gewebe haben eine lineare Beziehung im Sauerstoffverbrauch, während andere in bestimmten Konzentrationsbereichen eine verbesserte Empfindlichkeit und maximale Oxidation aufweisen. Die gewählte Gewebekonzentration sollte optimiert werden, um den Sauerstofffluss zu maximieren und gleichzeitig die Anzahl der Reoxygenierungsereignisse zu begrenzen. Darüber hinaus ist es oft besser, den Bedarf zu überschätzen oder das obere Ende des Konzentrationsbereichs anzustreben. Die Inhibitoren, die für die Quantifizierung von Atemwegen unerlässlich sind, sind präziser, wenn sie in größeren Mitochondrienpools eingesetzt werden.
Eine weitere wesentliche Überlegung ist die Konzentration der Medikamente, die während der Protokolle verwendet werden. Änderungen der Homogenatkonzentration können die Konzentrationen von Substraten, Entkopplern und Inhibitoren verändern, die für ein maximales Ansprechen erforderlich sind. Sobald also der optimale Konzentrationsbereich ausgewählt ist, sollte ein Experiment durchgeführt werden, in dem die für das SUIT-Protokoll erforderlichen Dosen getestet werden. Zusätzliches ADP kann hinzugefügt werden, um sicherzustellen, dass die Adenylatkonzentrationen nicht auf Atemflüsse beschränkt sind. Chemische Entkoppler wie FCCP oder CCCP hemmen die Atmung bei höheren Konzentrationen22. Daher ist es wichtig, in kleinen Mengen zu titrieren, um die maximal erreichte Rate aufzudecken. Inhibitoren wie Rotenon und Antimycin A werden am besten verwendet, wenn sie innerhalb der ersten Injektion gesättigt werden. Während in Vorversuchen optimale Konzentrationen bestimmt wurden, haben wir auch behandlungsbedingte Unterschiede in der Reaktion auf Inhibitoren beobachtet und fügen daher oft eine zusätzliche Injektion von Inhibitoren hinzu, um eine maximale Hemmung nachzuweisen, da die resultierenden Raten als Grundlage für die Quantifizierung dienen. Die chemische Hemmung von Ascorbat/TPMD ist für eine genaue analytische Reduktion unerlässlich, da TMPD einer Autooxidation unterzogen wird23. Wir kontrollierten die Autooxidation von Ascorbat / TMPD / Cytochrom c durch die Zugabe von Natriumazid, einem etablierten CIV-Inhibitor. Für die Km-Studien verhindert die Zugabe von Rotenon in Gegenwart von Succinat allein die Oxalacetatakkumulation, die die Succinatdehydrogenase-Aktivität bei niedrigen Konzentrationen hemmen kann24. Das Volumen und die Konzentration von ADP hängen stark von der Empfindlichkeit der Mitochondrien gegenüber der vorherrschenden Substratkombination ab. Mitochondriale Präparate, die sehr empfindlich auf ADP reagieren, erfordern niedrigere Ausgangskonzentrationen. Darüber hinaus sind validierte Chemikalien und die richtige Arzneimittelaufbereitung unter Berücksichtigung des pH-Wertes, der Lichtempfindlichkeit (falls zutreffend) und der Lagertemperatur für erfolgreiche Experimente unerlässlich.
Instrumentenaufbau und Routinepflege sind für den Erfolg dieser Experimente von entscheidender Bedeutung. Eine angemessene und ordnungsgemäße Reinigung der Kammern ist für die Reproduzierbarkeit und Vorbeugung von biologischen, Protein-, Inhibitor- oder Unkopplikatorenkontaminationen unerlässlich. Clark-Elektroden und O2k-Systeme verwenden Glasreaktionskammern, was einen erheblichen Kostenvorteil gegenüber plattenbasierten Systemen darstellt, die auf Verbrauchsmaterialien angewiesen sind. Die Glaskammern müssen jedoch kräftig gereinigt werden und können in späteren Studien eine Quelle der Inhibitorkontamination sein. Die Inkubation mit mitochondrienreichen Proben während des Waschprozesses (z. B. isolierte Herz- oder Lebermitochondrien) kann das Risiko einer experimentellen Kontamination verringern und wird zusätzlich zu Verdünnungs- und alkoholbasierten Waschverfahren empfohlen. Wenn konsekutive Studien durchgeführt werden, minimiert die Reinigung mit Ethanol und Mitochondrien die Möglichkeit einer Inhibitorkontamination. Die Kalibrierung des Sauerstoffsensors wird vor jedem Experiment empfohlen, um genaue Messungen der Atmung relativ zum vorherrschenden Sauerstoffpartialdruck zu erhalten. Wenn mehrere Kalibrierungen nicht durchführbar sind, kann eine Kalibrierung pro Tag ausreichen, wenn die Sauerstoffkonzentration nach dem Waschvorgang stabil und konstant bleibt.
Die oben beschriebenen Verfahren nutzen das Oroboros O2k-Instrument zur Messung des Sauerstoffverbrauchs im Tumorgewebe innerhalb von 4 Stunden nach der Tumorexzision unter Verwendung einer zuvor entwickelten und optimierten Konservierungslösung und der Beatmungsmedien25,26,27. Mehrere Parameter in diesem Protokoll können für nachfolgende Anwendungen geändert werden. Der Geräteaufbau und die Kalibrierung, die homogenisatoren, die für die Gewebevorbereitung verwendet werden, und die optimale Homogenat- und Kammersauerstoffkonzentration können alle für den Einsatz auf anderen Instrumenten mit Sauerstoffüberwachungspotenzial angepasst werden. Zum Beispiel wurden die Kammern beim Hinzufügen von Homogenat leicht überfüllt, und wenn die Kammer vollständig geschlossen ist, bleibt die Kammerkapillar voll. Dies verbraucht etwas Sauerstoff in der Kammer, aber mit der Optimierung der Probenkonzentration können wir diesen Verbrauch bei der Bestimmung des Sauerstoffgehalts berücksichtigen, mit dem wir beginnen sollen. Alternativ kann die Probe bei Umgebungssauerstoff ausgeglichen werden, bevor die Kammer geschlossen wird, aber dies erhöht oft die Zeitspanne vor Beginn des Experiments und verzögert die Zugabe von Substraten. Während die in diesem Protokoll verwendeten Homogenisatoren allgemein zugänglich sind, könnten andere kommerzielle Homogenisierungstechniken eingesetzt werden, wie z.B. ein Gewebezerkleinerer oder ein automatisierter Homogenisator28.
Darüber hinaus können die Gewebevorbereitungs- und Instrumentenverfahren mit einer Reihe verschiedener SUITs verwendet werden, um die Atemkontrolle durch eine Vielzahl von Kopplungs- und Signalwegkontrollzuständen zu untersuchen29. Diese SUIT-Protokolle wurden entwickelt, um die Funktionsfähigkeit zu messen, und somit hat der Beitrag potenzieller endogener Substrate keinen Einfluss auf die Kapazitätsmessung. Wir berücksichtigen analytisch den nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und/oder den Restverbrauch des Homogenats durch Subtraktion des Antimycin-A-Rotenons bzw. natriumazidunempfindlicher Raten. Mitochondrien können in BIOPS oder ähnlich aufgebauten Konservierungslösungen für längere Zeit (>24 h) lebensfähig bleiben, abhängig von Gewebetyp und Unversehrtheit30,31. Studien können im Voraus durchgeführt werden, um die zeitlichen Lagergrenzen zu bestimmen, da OXPHOS bestimmter Substrate unterschiedliche Einschränkungen haben kann. Dies ist unerlässlich, wenn das Experiment nicht innerhalb weniger Stunden nach der Gewebeexzision / Biopsie durchgeführt werden kann. 37°C ist eine optimale und physiologische Temperatur zur Beurteilung der Atmungsfunktion in den meisten Säugetiersystemen. Wenn jedoch die Assay-Temperatur die Bewertung32zu stören scheint, können Vergleichsstudien über einen weiten Temperaturbereich (25-40 °C) durchgeführt werden, um eine angemessene Reaktionsfähigkeit zu gewährleisten. Instrumentelle Einschränkungen können die Fähigkeit zur Durchführung solcher Studien einschränken.
Haupteinschränkungen der oben beschriebenen Methode sind 1) das Potenzial für eine Schädigung der Mitochondrien durch mechanische Homogenisierung, 2) das Vorhandensein von ATPasen oder anderen subzellulären Biochemikalien in Homogenatpräparaten, die die gleichzeitige Bestimmung von ATP oder anderen Variablen von Interesse stören können und zusätzliche Korrekturmethoden erfordern oder Inhibitoren verwenden33 , und 3) die Auswertung vieler Proben und/oder mehrerer SUITs pro Probe ist zeitaufwendig, da ein Instrument zwei Experimente gleichzeitig aufnehmen kann und zwischen aufeinanderfolgenden Experimenten gereinigt und eingerichtet werden muss. Optimierungsexperimente und die konsistente Aufbereitung von Proben können erhebliche mitochondriale Schäden minimieren, die zu inkonsistenten Daten beitragen würden.
Die Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/alternative Methoden ist eine verbesserte Machbarkeit im Vergleich zur Menge an Ausgangsmaterial, die Herausforderung der Isolierung von Mitochondrien oder die technische Herausforderung bei der Permeabilisierung von Gewebe. Die Herstellung von Homogenaten ist schneller, Sauerstoff ist nicht annähernd so limitierend und ist im Vergleich zu permeabilisiertem Gewebe weniger anfällig für Variabilität zwischen dem Personal. Wichtig ist, dass fast alle Probentypen für die Homogenatvorbereitung geeignet sind, was eine vergleichende Analyse über Gewebe hinweg ermöglicht. Die hochauflösende Respirometrie ist die Goldstandardmessung von mitochondrialen OXPHOS und ET. Die Anwendung dieser Methode in der präklinischen und klinischen Krebsforschung hat die Fähigkeit, aktuelle In-vitro-Untersuchungen auf Ex-vivo-Studien auszuweiten. Darüber hinaus bietet es potenzielle Anwendungen im klinischen und diagnostischen Umfeld.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Mitarbeitern des Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core für die Tierpflege. Diese Forschung wurde zum Teil durch die Zuschüsse des National Institute of Health U54GM104940 (JPK) und KL2TR003097 (LAG) unterstützt. Alle Experimente und Verfahren mit Tieren wurden vom Pennington Biomedical Research Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free | Sigma-Aldrich | 3117057001 | Roche |
BD 50 mL Luer-Lok Syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Datlab 7.4 software | Oroboros Instruments | ||
Dimethylsulfoxide | Amresco | N182 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumoxel, autoclavable |
Dumont # 7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumoxel, autoclavable |
Digital Calipers 150 mm/6 in | World Precision Instruments | 501601 | |
EO771 cells | CH3 BioSystems | SKU: 94APV1-vial-prem | Pathogen Tested |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock #000664 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 34120 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | L2398 | |
Malate | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
MgCl·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Microsyringes | Hamilton | 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | |
Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10023-03 | |
Oxygraph-2k FluoRespirometer | Oroboros Instruments | 10003-01 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875034 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Succinate (disodium) | Sigma-Aldrich | W327700 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Whatman Filter Paper, grade 5 | Sigma-Aldrich | 1005-090 | |
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL | Duran Wheaton Kimble | 357424 | |
Straight Tip Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5914SC | |
Non-Safety Scalpel No. 11 | McKesson | 1029065 | |
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 | Becton, Dickinson and Company | 305109 | |
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 | Becton, Dickinson and Company | 305195 | |
BD 1mL Slip Tip Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 316060 | |
Rodent Very High Fat Diet, 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate | Research Diet | D12492 | |
Pyrex Watch Glass, 100 mm | Thermo Fisher Scientific | S34819 |