Мы разработали практический протокол и аналитический подход для оценки митохондриального окислительного фосфорилирования и способности переноса электронов в свежих гомогенатах опухоли. Этот протокол может быть легко адаптирован для изучения различных митохондриальных функций, которые способствуют инициации, прогрессированию рака и ответу на лечение.
Митохондрии необходимы для возникновения и прогрессирования рака посредством производства энергии, регуляции активных форм кислорода и синтеза макромолекул. Генетические и функциональные адаптации митохондрий к опухолевой среде стимулируют пролиферативный и метастатический потенциал. Появление секвенирования ДНК и РНК устранило критические барьеры для оценки генетических медиаторов опухолевого генеза. Однако на сегодняшний день методологические подходы к оценке митохондриальной функции опухоли остаются неуловимыми и требуют технического мастерства, ограничивающего осуществимость, в конечном итоге уменьшая диагностическую и прогностическую ценность как в экспериментальных, так и в клинических условиях. Здесь мы описываем простой и быстрый метод количественной оценки скорости окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и переноса электронов (ET) в свежеиссекенных твердых гомогенатах опухоли с использованием респирометрии высокого разрешения. Протокол может быть воспроизводимо применен к видам и типам опухолей, а также адаптирован для оценки разнообразия митохондриальных et-путей. Используя этот протокол, мы демонстрируем, что мыши, перенесшие люминальный рак молочной железы B, демонстрируют дефектное никотинамид-динуклеотид-связанное дыхание и зависимость от сукцината для получения аденозинтрифосфата через OXPHOS.
Все клетки тесно связаны своей потребностью производить и потреблять аденозинтрифосфат (АТФ), молекулярную энергетическую валюту. Поскольку клеточные мутации приводят к образованию опухолей, митохондрии обеспечивают выживание за счет диверсификации производства энергии, которая часто фенотипически отличается от нераковойткани 1,2,3. Таким образом, существует острая необходимость в быстром и глубоком профилировании дыхательной функции митохондрий, чтобы облегчить классификацию типа опухоли, инициации рака, прогрессирования и ответа на лечение.
Дыхательные функции образцов иссеченной ткани не могут быть оценены неповрежденными, поскольку первичные субстраты для OXPHOS не являются клеточно-проницаемыми. Чтобы преодолеть это ограничение, митохондрии могут быть получены либо путем выделения, химической пермеабилизации, либо механической гомогенизации. Митохондриальная изоляция долгое время считалась золотым стандартом для оценки дыхательной функции. Тем не менее, он требует большого количества ткани, занимает много времени и является низкопродуктивным с возможным смещением отбора для определенных фракций митохондрий4. Пермеабилизация состоит из механического разделения и воздействия на участки тканей или пучки волокон мягкого моющего средства, которое избирательно разлагает плазматическую мембрану5. Пермеабилизация часто используется в поперечно-полосатых тканях, таких как скелетная и сердечная мышцы, поскольку отдельные пучки волокон могут быть разделены. По сравнению с изоляцией, пермеабилизация дает больше митохондрий в их родной клеточной среде и физической форме5. Пермеабилизация успешно применяется в других тканях, таких как опухоль6,7 и плацента8; однако воспроизводимость пермеабилизированных волоконных препаратов может быть затруднена из-за консистенции рассечения и потребностей в кислороде для преодоления диффузионных ограничений9. Кроме того, пермеабилизированные волокна могут быть непригодны для некоторых типов опухолей, которые являются плотно клеточными и высокофиброзными. Тканевые гомогенаты образуются путем механического разрушения плазматической мембраны и аналогичны пермеабилизированным волокнам с точки зрения выхода митохондрий и целостности10. Тканевые гомогенаты также минимизируют ограничения диффузии кислорода и могут быть легко использованы между типами тканей путем оптимизации механической силы11,12.
Здесь мы описываем простой и быстрый метод количественной оценки скорости окислительного фосфорилирования (OXPHOS) и способности переноса электронов (ET) в свежеиссеченных твердых гомогенатах опухоли. Протокол оптимально разработан для оценки свежих тканей с использованием респирометра высокого разрешения Oxygraph-2k (O2k), который требует предварительных знаний инструментальной настройки и калибровки, но может быть аналогичным образом адаптирован с использованием любого электрода типа Кларка, анализатора Seahorse или считывателя пластин. Протокол может быть воспроизводимо применен к видам и типам опухолей, а также адаптирован для оценки разнообразия митохондриальных et-путей.
Подходы к оценке митохондриального дыхания при раке в значительной степени были ограничены моделями in vitro 13,14,15,16. Некоторые успехи были достигнуты в измерении митохондриального дыхания в опухолях с использованием химической пермеабилизации6,7,17,но не существует единого подхода золотого стандарта, который можно было бы универсально применять и сравнивать между типами опухолей. Кроме того, отсутствие последовательного анализа данных и отчетности ограничивает обобщаемость и воспроизводимость данных. Способ, описанный в настоящем описании, обеспечивает простой, относительно быстрый подход к измерению митохондриального дыхания18 в митохондриальных препаратах из свежеиссеченных твердых образцов опухолей. Опухоли были выращены из ортотопически имплантированных мышиных люминальных В, ERα-отрицательных EO771 клеток рака молочной железы19.
Усердие и осторожность при обращении с тканями значительно повысят точность и нормализацию норм потребления кислорода. Ткань и митохондрии могут быть легко повреждены, если образец не остается холодным, не постоянно погружается в консервационные среды или чрезмерно обрабатывается, что приводит к неоптимальной рутине и скорости OXPHOS. Кроме того, точный влажный вес гомогенизированной ткани имеет решающее значение, поскольку это основной метод нормализации. Могут быть рассмотрены другие методы нормализации, такие как общий белок или митохондриальные специфические маркеры, такие как активность цитратсинтазы20. Кроме того, необходимо будет решить проблему неоднородности тканей, при этом решения о опухолевых областях должны быть включены в эксперименты, сделанные априори. Некротическая, фиброзная и соединительная ткань может не гомогенизироваться и / или хорошо дышать, и ее следует избегать, если намеренно не анализировать эти опухолевые области. Примечательно, что опухоль может быть очень липкой в зависимости от типа и области иссечения, что затрудняет точное взвешивание и перенос. Количество ударов, используемых для гомогенизации, должно быть оптимизировано для обеспечения полной подготовки митохондрий при одновременном смягчении повреждения наружных митохондриальных мембран.
Для повышения точности и воспроизводимости мы рекомендуем проводить эксперименты по оптимизации количества штрихов для гомогенатного препарата, концентрации в тканях, а также концентраций субстрата, разъединителя, ингибитора. Исследования могут сравнивать различное количество инсультов и то, как они соответствуют реакции на добавление цитохрома c в рамках исследования, а также максимальную митохондриальную дыхательную способность 21. Хотя существует общее признание того, что меньший ответ цитохрома C лучше, поскольку увеличение потребления кислорода после добавления цитохрома c может указывать на повреждение внешней митохондриальной мембраны, не существует золотого стандарта в отношении того, каков этот порог для каждой ткани, и его следует экспериментально исследовать, чтобы гарантировать, что ткань не перегружена или недостаточно подготовлена. В этой опухолевой ткани было обнаружено, что ответ цитохрома c под ~ 30% не ухудшает дыхательную функцию. Использование цитохрома c становится критически важным для точной количественной оценки дыхательной способности, если тест положительный. В этом случае добавка восполняет эндогенный цитохром с, который при истощении вызовет недооценку дыхательных путей.
Эксперименты по титрованию концентрации в тканях могут быть выполнены в диапазоне возможных концентраций и, в идеале, должны проводиться с помощью SUIT, которые будут исследованы во время исследования. Дыхательная способность будет варьироваться в зависимости от типа и состава опухоли. Таким образом, опухоли плотные с митохондриями или высокой дыхательной способностью потребуют более низких концентраций (0,5-5 мг/мл). Опухоли с небольшим количеством митохондрий или низкой дыхательной способностью потребуют более высоких концентраций (7-12 мг / мл). Кроме того, SUIT, которые являются длинными или имеют высокопотребляемые субстраты, могут нуждаться в меньшем количестве ткани для предотвращения реоксигенации камеры или ограничения АДФ. Некоторые ткани будут иметь линейную зависимость в потреблении кислорода, тогда как другие будут демонстрировать улучшенную чувствительность и максимальное окисление в определенных диапазонах концентраций. Выбранная концентрация в тканях должна быть оптимизирована для максимизации потока кислорода при одновременном ограничении количества событий реоксигенации. Кроме того, часто лучше переоценить необходимость или стремиться к более высокому пределу диапазона концентраций. Ингибиторы, которые необходимы для количественного определения дыхательных потоков, более точны при использовании в больших пулах митохондрий.
Другим важным соображением является концентрация лекарств, которые используются во время протоколов. Изменения концентрации гомогенатов могут изменять концентрации субстратов, разъединителей и ингибиторов, необходимые для максимального ответа. Таким образом, как только оптимальный диапазон концентраций выбран, следует провести эксперимент, проверяющий дозы, необходимые для протокола SUIT. Дополнительный АДФ может быть добавлен для обеспечения того, чтобы концентрации аденилата не ограничивались дыхательными потоками. Химические разъединители, такие как FCCP или CCCP, будут ингибировать дыхание при более высоких концентрациях22. Таким образом, важно титровать в небольших количествах, чтобы выявить максимально достигнутую скорость. Ингибиторы, такие как ротенон и антимицин А, лучше всего использовать при насыщении в течение первой инъекции. В то время как оптимальные концентрации были определены в предварительных экспериментах, мы также наблюдали связанные с лечением различия в реакции на ингибиторы и, таким образом, часто добавляли одну дополнительную инъекцию ингибиторов, чтобы продемонстрировать максимальное ингибирование, поскольку результирующие скорости служат основой для количественной оценки. Химическое ингибирование аскорбата/TPMD имеет важное значение для точного аналитического восстановления, поскольку TMPD подвергается автоокислению23. Мы контролировали автоокисление аскорбата/TMPD/цитохрома c путем добавления азида натрия, установленного ингибитора CIV. Для исследований Km добавление ротенона в присутствии только сукцината предотвращает накопление оксалоацетата, который может ингибировать активность сукцинатдегидрогеназы при низких концентрациях24. Объем и концентрация АДФ сильно зависят от чувствительности митохондрий к преобладающей комбинации субстратов. Митохондриальные препараты, которые очень чувствительны к АДФ, потребуют более низких начальных концентраций. Кроме того, для успешных экспериментов необходимы проверенные химические вещества и надлежащая подготовка лекарств с вниманием к рН, чувствительности к свету, если это применимо, и температуре хранения.
Настройка приборов и рутинный уход имеют решающее значение для успеха этих экспериментов. Адекватная и надлежащая очистка камер имеет важное значение для воспроизводимости и предотвращения биологического, белкового, ингибиторного или разъединяющего загрязнения. Электроды типа Clark и системы O2k используют стеклянные реакционные камеры, что является значительным преимуществом в стоимости для пластинчатых систем, которые полагаются на расходные материалы. Однако стеклянные камеры должны быть тщательно очищены и могут быть источником ингибирующего загрязнения в последующих исследованиях. Инкубация с богатыми митохондриями образцами во время процесса промывания (например, изолированные митохондрии сердца или печени) может снизить риск экспериментального загрязнения и рекомендуется в дополнение к процедурам разбавления и промывки на спиртовой основе. При проведении последовательных исследований очистка этанолом и митохондриями сводит к минимуму возможность заражения ингибиторами. Калибровка датчика кислорода рекомендуется перед каждым экспериментом для получения точных измерений дыхания относительно преобладающего парциального давления кислорода. Если несколько калибровок невозможны, одной калибровки в день может быть достаточно, если концентрация кислорода остается стабильной и постоянной после процедуры стирки.
Процедуры, описанные выше, используют инструмент Oroboros O2k для измерения потребления кислорода в опухолевой ткани в течение 4 часов после иссечения опухоли с использованием ранее разработанного и оптимизированного консервационного раствора и дыхательных сред25,26,27. Несколько параметров в этом протоколе могут быть изменены для последующих применений. Настройка и калибровка прибора, гомогенизаторы, используемые для подготовки тканей, а также оптимальная концентрация гомогената и кислорода в камере могут быть адаптированы для использования на других приборах с потенциалом мониторинга кислорода. Например, камеры были слегка переполнены при добавлении гомогената, и, таким образом, когда камера полностью закрыта, капилляр камеры остается заполненным. Это будет потреблять некоторое количество кислорода в камере, но с оптимизацией концентрации образца мы можем учесть это потребление при определении того, с какого уровня кислорода начать. В качестве альтернативы, образцу можно позволить уравновеситься при окружающем кислороде до закрытия камеры, но это часто увеличивает количество времени до начала эксперимента и задерживает добавление подложек. В то время как гомогенизаторы, используемые в этом протоколе, широко доступны, могут быть использованы другие коммерческие методы гомогенизации, такие как измельчитель тканей или автоматизированный гомогенизатор28.
Кроме того, тканевая подготовка и инструментальные процедуры могут быть использованы с рядом различных SUIT для изучения респираторного контроля с помощью различных состояний связи и контроля путей29. Эти протоколы SUIT были разработаны для измерения функциональной емкости, и, таким образом, вклад потенциальных эндогенных субстратов не влияет на измерение емкости. Мы аналитически учитываем немитохондриальное потребление кислорода и/или остаточное потребление гомогената путем вычитания антимицина А-ротенона или нечувствительных к азиду натрия скоростей, в зависимости от обстоятельств. Митохондрии могут оставаться жизнеспособными в BIOPS или аналогично построенных растворах для сохранения в течение длительных периодов времени (>24 ч) в зависимости от типа ткани и интактности30,31. Исследования могут быть проведены заранее для определения временных пределов хранения, поскольку OXPHOS определенных субстратов может иметь различные ограничения. Это важно, если эксперимент не может быть выполнен в течение нескольких часов после иссечения ткани / биопсии. 37°C является оптимальной и физиологической температурой для оценки дыхательной функции в большинстве систем млекопитающих. Однако, если температура анализа, по-видимому, мешает оценке32,сравнительные исследования могут быть проведены в широком температурном диапазоне (25-40 °C) для обеспечения адекватной реакции. Инструментальные ограничения могут ограничивать способность проводить такие исследования.
Основными ограничениями вышеописанного способа являются: 1) возможность повреждения митохондрий в результате механической гомогенизации, 2) наличие АТФаз или других субклеточных биохимических веществ в гомогенатных препаратах, которые могут мешать одновременному определению АТФ или других интересующих переменных и могут потребовать дополнительных методов коррекции или использования ингибитора33 и 3) оценка многих образцов и/или нескольких SUIT на выборку занимает много времени, поскольку один инструмент может вместить два эксперимента одновременно и требует очистки и установки между последовательными экспериментами. Эксперименты по оптимизации и последовательная подготовка образцов могут свести к минимуму существенное повреждение митохондрий, которое будет способствовать противоречивым данным.
Значение метода по отношению к существующим/альтернативным методам заключается в улучшении осуществимости по сравнению с количеством исходного материала, проблемой выделения митохондрий или технической проблемой в пермеабилизирующей ткани. Приготовление гомогенатов происходит быстрее, кислород не так ограничен и менее подвержен изменчивости между персоналом по сравнению с пермеабилизированной тканью. Важно отметить, что почти все типы образцов подходят для гомогенатной подготовки, что позволяет проводить сравнительный анализ по тканям. Респирометрия высокого разрешения является золотым стандартом измерения митохондриальных OXPHOS и ET. Применение этого метода в доклинических и клинических исследованиях рака позволяет расширить текущие исследования in vitro до исследований ex vivo. Кроме того, он предлагает потенциальное применение в клинических и диагностических условиях.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим сотрудников Pennington Biomedical Research Center Comparative Biology Core за уход за животными. Это исследование было частично поддержано грантами Национального института здравоохранения U54GM104940 (JPK) и KL2TR003097 (LAG). Все эксперименты и процедуры с участием животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Пеннингтонского биомедицинского исследовательского центра.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free | Sigma-Aldrich | 3117057001 | Roche |
BD 50 mL Luer-Lok Syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Datlab 7.4 software | Oroboros Instruments | ||
Dimethylsulfoxide | Amresco | N182 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumoxel, autoclavable |
Dumont # 7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumoxel, autoclavable |
Digital Calipers 150 mm/6 in | World Precision Instruments | 501601 | |
EO771 cells | CH3 BioSystems | SKU: 94APV1-vial-prem | Pathogen Tested |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock #000664 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 34120 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | L2398 | |
Malate | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
MgCl·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Microsyringes | Hamilton | 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | |
Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10023-03 | |
Oxygraph-2k FluoRespirometer | Oroboros Instruments | 10003-01 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875034 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Succinate (disodium) | Sigma-Aldrich | W327700 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Whatman Filter Paper, grade 5 | Sigma-Aldrich | 1005-090 | |
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL | Duran Wheaton Kimble | 357424 | |
Straight Tip Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5914SC | |
Non-Safety Scalpel No. 11 | McKesson | 1029065 | |
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 | Becton, Dickinson and Company | 305109 | |
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 | Becton, Dickinson and Company | 305195 | |
BD 1mL Slip Tip Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 316060 | |
Rodent Very High Fat Diet, 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate | Research Diet | D12492 | |
Pyrex Watch Glass, 100 mm | Thermo Fisher Scientific | S34819 |