우리는 신선한 종양 균질화에서 미토콘드리아 산화 인산화 및 전자 전달 용량을 평가하기 위한 실용적인 프로토콜 및 분석 접근법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 암 개시, 진행 및 치료 반응에 기여하는 다양한 미토콘드리아 기능을 조사하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다.
미토콘드리아는 에너지 생산, 반응성 산소 종 조절 및 거대 분자 합성을 통해 암의 발병 및 진행에 필수적입니다. 미토콘드리아의 유전적 및 기능적 적응은 종양 환경에 대한 확산 및 전이성 전위 잠재력을 유발합니다. DNA와 RNA 염기서열 분석의 출현은 종양 발생의 유전 중재자의 평가에 중요한 장벽을 제거했습니다. 그러나 현재까지 종양 미토콘드리아 기능을 평가하기 위한 방법론적 접근법은 여전히 애매하며 타당성을 제한하는 기술적 숙련도가 필요하며 궁극적으로 실험 및 임상 설정 모두에서 진단 및 예후 값을 감소시다. 여기서, 우리는 고해상도 호흡법을 사용하여 갓 절제된 고형 종양 균질화에서 산화 인산화(OXPHOS) 및 전자 전달(ET) 용량의 비율을 정량화하는 간단하고 신속한 방법을 간략하게 설명합니다. 프로토콜은 종 및 종양 모형에 걸쳐 재보적으로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 미토콘드리아 ET 통로의 다양성을 평가하기 위하여 적응될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 발광 B 유방암을 가진 마우스가 OXPHOS를 통해 아데노신 삼위산염을 생성하기 위하여 간결한 에 결함이 있는 니코틴아마미드 adenine dinucleotide 연결호흡 및 의존을 전시한다는 것을 보여줍니다.
모든 세포는 분자 에너지 통화인 아데노신 트리호스페이트(ATP)를 생산하고 섭취해야 할 필요성에 의해 밀접하게 연결됩니다. 세포 돌연변이가 종양의 형성을 초래함에 따라, 미토콘드리아는 비암조직1,2,3과일반적으로 구별되는 에너지 생산의 다양화를 통해 생존을 보장한다. 이와 같이, 종양 유형, 암 개시, 진행 및 치료 반응의 분류를 용이하게 하기 위해 미토콘드리아 호흡 기능의 신속하고 깊은 프로파일링을 위한 중요한 필요성이 있다.
OXPHOS에 대한 1차 기판은 세포 투과성이 없기 때문에 절제된 조직 표본의 호흡 기능은 그대로 평가될 수 없다. 이러한 한계를 극복하기 위해 미토콘드리아는 절연, 화학 적 투과성 또는 기계적 균질화에 의해 제조 될 수 있습니다. 미토콘드리아 절연은 호흡기 기능의 평가를 위한 금 본위제로 오랫동안 간주됩니다. 그러나, 그것은 조직의 다량을 필요로하고, 시간이 많이 소요되며, 미토콘드리아4의특정 분획에 대한 가능한 선택 편향으로 낮은 항복이다. 과미성화는 플라즈마 멤브레인5를선택적으로 저하시키는 온화한 세제에 대한 조직 섹션 또는 섬유 번들의 기계적 분리 및 노출로 구성된다. 개별 섬유 번들이 따로 놀릴 수 있기 때문에 투과는 골격 및 심장 근육과 같은 현저한 조직에서 자주 사용됩니다. 격리에 비해, 투과성 생성은 그들의 네이티브 세포 환경 및 물리적 양식 5에서 더 많은 미토콘드리아를산출합니다. 과미성비화는 종양6,7 및 태반8과같은 다른 조직에서 성공적으로 적용되었습니다. 그러나, 퍼미빌리화섬유 제제의 재현성은 해부 및 산소 요구 사항의 일관성으로 인해 확산한계를극복하기 위해 어려울 수 있다 9. 추가적으로, 과소 섬유는 조밀하게 세포및 높게 섬유성인 특정 종양 모형에서 부적당할 지도 모릅니다. 조직 균질화는 플라즈마 멤브레인의 기계적 중단을 통해 생성되며 미토콘드리아 수율 및무결성(10)의관점에서 과구 섬유와 유사하다. 조직 균질화는 또한 산소 확산의 한계를 최소화하고 기계적힘(11,12)의최적화를 통해 조직 유형 전반에 걸쳐 용이하게 사용될 수 있다.
여기서, 우리는 신선하게 절제된 고형 종양 균질화에서 산화 인산화(OXPHOS) 및 전자 전달(ET) 용량의 비율을 정량화하는 간단하고 신속한 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 기악 설정 및 교정에 대한 사전 지식이 필요하지만 클라크 형 전극, 해마 분석기 또는 플레이트 판독기를 사용하여 유사하게 조정할 수있는 Oxygraph-2k (O2k) 고해상도 호흡을 사용하여 신선한 조직을 평가하기 위해 최적으로 설계되었습니다. 프로토콜은 종 및 종양 모형에 걸쳐 재보적으로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 미토콘드리아 ET 통로의 다양성을 평가하기 위하여 적응될 수 있습니다.
암에서 미토콘드리아 호흡을 평가하는접근법은 주로 시험관 내 모델(13,14,15,16)으로제한되었다. 화학적 투과성6,7,17을사용하여 종양에서 미토콘드리아 호흡을 측정하는 데 있어 일부 성공이 달성되었지만, 보편적으로 적용되고 종양 유형 전반에 걸쳐 비교할 수 있는 균일한 금표준 접근법은 없습니다. 또한 일관된 데이터 분석 및 보고가 부족하여 데이터 일반화성과 재현성이 제한됩니다. 본 원에 설명된 방법은 미토콘드리아호흡(18)을 측정하기 위한 간단하고 비교적 빠른 접근법을 제공하여 미토콘드리아 제제에서 갓 절제된 고형 종양 시편으로부터 제조한다. 종양은 정형소 이식된 뮤린 루미날 B, ERα-음성 EO771유방암세포(19)로부터성장하였다.
조직 취급에 대한 부지런함과 관리는 산소 소비율의 정확성과 정상화를 크게 향상시킬 것입니다. 조직과 미토콘드리아는 시료가 차갑게 유지되지 않거나, 보존 매체에 일관되게 침수되지 않거나, 지나치게 처리되어 최적이 아닌 루틴 및 OXPHOS 비율을 초래하는 경우 쉽게 손상될 수 있다. 추가적으로, 균질화 조직의 정확한 젖은 무게는 이것이 1 차적인 정규화 방법이기 때문에 중요한 중요성입니다. 구연산 신디하제활성(20)과같은 총 단백질 또는 미토콘드리아 특이적 마커와 같은 다른 정상화 방법이 고려될 수 있다. 추가적으로, 조직 이질성은 실험에 포함하기 위하여 종양 지구에 관하여 결정과 더불어 해결될 필요가 있을 것입니다 선행을 했습니다. 괴사, 섬유성 및 결합 조직은 균질화 및/또는 호흡을 잘 하지 않을 수 있으며 이러한 종양 부위를 의도적으로 분석하지 않는 한 피해야 합니다. 특히, 종양은 유형 및 절제 부위에 따라 매우 끈적거리며 정확한 계량 및 이송이 더 어려워질 수 있습니다. 균질화에 사용되는 뇌졸중의 수는 외부 미토콘드리아 막에 손상을 완화하면서 미토콘드리아의 완전한 준비를 보장하기 위해 최적화되어야한다.
향상된 정확도와 재현성을 위해, 우리는 균질 제제, 조직 농도 및 기질, 비 커플러, 억제제 농도에 대한 뇌졸중의 수에 대한 최적화 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 연구는 뇌졸중의 다른 수와 그들이 연구 내에서 사이토 크롬 c의 첨가에 반응하는 방법과 최대 미토콘드리아 호흡 용량 (21)을비교할 수 있습니다. 시토크롬 c 응답이 적다는 일반적인 수용이 있지만, 사이토크롬 c를 첨가한 후 산소 소비가 증가함에 따라 외부 미토콘드리아 막에 손상을 나타낼 수 있으며, 이 임계값이 모든 조직에 대해 어떤 기준인지에 관해서는 금본위제가 없으며 조직이 과로되거나 준비되지 않도록 실험적으로 조사되어야 한다. 이 종양 조직에서는~ 30% 미만의 사이토크롬 c 반응이 호흡기 기능을 손상시키지 않는 것으로 나타났다. Cytochrome c 사용은 시험이 양성인 경우에 호흡 용량의 정확한 정량화를 위해 중요하게 됩니다. 이 경우, 추가 보충 내인성 사이토크롬 c, 이는, 고갈하는 경우, 호흡 속도의 과소 평가를 일으킬 것이다.
조직 농도 적정 실험은 가능한 농도의 범위에 걸쳐 수행 될 수 있으며, 이상적으로, 연구 중에 조사 될 SUITs로 수행 될 것이다. 호흡 용량은 종양 유형 및 조성물에 따라 다릅니다. 따라서, 미토콘드리아 또는 높은 호흡 용량으로 조밀한 종양은 낮은 농도(0.5-5 mg/mL)를 필요로 한다. 미토콘드리아 또는 낮은 호흡 용량을 가진 종양은 더 높은 농도 (7-12 mg/mL)를 요구할 것입니다. 추가적으로, 길고 고도로 소모된 기질이 있는 SUITs는 챔버 또는 ADP 제한의 재산소화를 방지하기 위하여 더 적은 조직을 필요로 할 수 있습니다. 몇몇 조직은 산소 소비에 있는 선형 관계가 있을 것이고, 그 외는 특정 사격량에 향상된 감도 및 최대 산화를 보여줄 것입니다. 선택한 조직 농도는 산소 플럭스를 최대화하는 동시에 재산소 화 사건의 수를 제한하도록 최적화되어야 합니다. 또한, 농도 범위의 높은 끝에 대 한 필요 또는 목표를 과대 평가 하는 것이 좋습니다. 호흡 플럭스의 양에 필수적인 억제제는 미토콘드리아의 더 큰 풀에서 사용될 때 더 정확합니다.
또 다른 필수적인 고려 사항은 프로토콜 중에 사용되는 약물의 농도입니다. 동종 포진 농도의 변화는 최대 반응에 필요한 기판, 분리제 및 억제제의 농도를 변경할 수 있습니다. 따라서 최적의 농도 범위를 선택하면 SUIT 프로토콜에 필요한 용량을 테스트하는 실험이 수행되어야 합니다. 아데닐레이트 농도가 호흡기 플럭스에 제한되지 않도록 추가ADP를 추가할 수 있습니다. FCCP 또는 CCCP와 같은 화학 비커플러는 더 높은농도(22)에서호흡을 억제한다. 따라서, 최대 달성 속도를 드러내기 위해 소량으로 적정화하는 것이 필수적입니다. 로테네톤 및 항마이신 A와 같은 억제제는 첫 번째 주사 내에서 포화 시 가장 잘 사용됩니다. 최적의 농도는 예비 실험에서 결정되었지만, 우리는 또한 억제제에 대한 반응에서 치료 관련 차이를 관찰하고 따라서 종종 결과 요금이 정량화의 기초로 작용함에 따라 최대 억제를 입증하기 위해 억제제의 1 개의 추가 주입을 추가합니다. TMPD가 자동산화(23)를거치면서 아스코르베이트/TPMD의 화학적 억제는 정확한 분석 적 감소에 필수적이다. 우리는 산화 나트륨 아지드의 추가를 통해 아스코르바테/TMPD/사이토크롬 c의 자동 산화를 위해 통제, 설립 된 CIV 억제제. Km 연구의 경우, 간결한 단독으로 로테네를 첨가하면저농도(24)에서간결한 탈수소효소 활성을 억제할 수 있는 옥살로아세테이트 축적을 방지한다. ADP의 부피 및 농도는 일반적인 기판 조합에 미토콘드리아의 감도에 크게 의존한다. ADP에 매우 민감한 미토콘드리아 제제는 더 낮은 시작 농도를 필요로 합니다. 또한 pH에 주의를 기울여 검증된 화학 물질및 적절한 약물 제제, 해당되는 경우 빛에 대한 민감성 및 저장 온도는 성공적인 실험에 필수적입니다.
악기 설정 및 일상적인 관리는 이러한 실험의 성공을 위해 매우 중요합니다. 챔버의 적절하고 적절한 청소는 생물학적, 단백질, 억제제 또는 커플러 오염의 재현성 및 예방에 필수적입니다. 클라크형 전극 및 O2k 시스템은 소모품에 의존하는 플레이트 기반 시스템에 상당한 비용 이점인 유리 반응 챔버를 활용합니다. 그러나 유리 챔버는 적극적으로 세척되어야하며 후속 연구에서 억제제 오염의 원인이 될 수 있습니다. 세척 과정에서 미토콘드리아가 풍부한 표본을 가진 배양(예를 들어, 고립된 심장 또는 간 미토콘드리아)은 실험 오염의 위험을 줄일 수 있으며 희석 및 알코올 기반 세척 절차 이외에 권장됩니다. 연속 적인 연구가 실행 되는 경우, 에탄올과 미토 콘 드리 아와 청소 억제제 오염의 가능성을 최소화. 산소 센서의 교정은 산소의 일반적인 부분 압력에 비해 호흡의 정확한 측정을 얻기 위해 각 실험 전에 권장됩니다. 다중 교정이 가능하지 않은 경우, 세척 시술 후 산소 농도가 안정적이고 일관된 상태를 유지하면 하루에 하나의 교정이 충분할 수 있습니다.
상술한 절차는 이전에 설계및 최적화된 보존 용액 및 호흡 매체25,26,27을사용하여 종양 절제 후 4시간 이내에 종양 조직에서 산소 소비를 측정하기 위한 Oroboros O2k 계측기를 활용한다. 이 프로토콜의 여러 매개 변수는 후속 응용 프로그램에 대해 수정할 수 있습니다. 기기 설정 및 교정, 조직 준비에 사용되는 균질화, 최적의 균질화 및 챔버 산소 농도는 모두 산소 모니터링 잠재력을 가진 다른 기기에 사용하기 위해 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 균주를 추가할 때 챔버가 약간 과밀되어 챔버가 완전히 닫히면 챔버 모세관이 가득 찼습니다. 이것은 챔버에 약간의 산소를 소비하지만, 샘플 농도의 최적화와 함께, 우리는 시작 산소 수준을 결정하는이 소비를 설명 할 수 있습니다. 대안적으로, 샘플은 챔버가 닫히기 전에 주변 산소에서 평형화할 수 있지만, 이것은 종종 실험이 시작되기 전에 시간의 양을 증가시키고 기판의 추가를 지연시킬 것이다. 이 프로토콜에 사용되는 균질화는 널리 접근 할 수 있지만, 조직 분쇄기 또는 자동화 된 균질화 기법과 같은 다른 상업적 균질화 기술을 사용할 수있습니다(28).
또한, 조직 제제 및 기기 절차는 다양한 SUIT와 함께 다양한 커플링 및 통로 제어상태(29)에의해 호흡기 조절을 연구할 수 있다. 이러한 SUIT 프로토콜은 기능 용량을 측정하기 위해 개발되었으며, 따라서 잠재적인 내인성 기판의 기여는 용량 측정에 영향을 미치지 않습니다. 당사는 항마이신 A-로테논 또는 아지드 나트륨 민감성의 감산을 통해 항미토콘드리아 산소 소비 및/또는 잔류 소비를 적절히 고려합니다. 미토콘드리아는 조직 유형 및 손상성30,31에따라 장기간(>24h)에 대해 생검 또는 유사하게 구성된 보존 용액에서 실행 가능한 상태를 유지할 수 있다. 특정 기판의 OXPHOS가 다른 한계를 가질 수 있기 때문에 시간적 저장 제한을 결정하기 위해 사전에 연구를 수행할 수 있습니다. 이것은 실험이 조직 절제/생검의 몇 시간 안에 수행될 수 없는 경우에 필수적입니다. 37°C는 대부분의 포유류 시스템에서 호흡 기능의 평가를 위한 최적 및 생리학적 온도이다. 그러나, 분석 온도가평가(32)를방해하는 것처럼 보이는 경우, 적절한 응답성을 보장하기 위해 넓은 온도 범위(25-40°C)에 걸쳐 비교 연구가 수행될 수 있다. 도구 적 제약은 그러한 연구를 수행하는 능력을 제한 할 수 있습니다.
전술한 방법의 주요 제한은 1) 기계적 균질화를 통한 미토콘드리아에 대한 손상 가능성, 2) ATP 또는 기타 관심 변수의 동시 결정을 방해할 수 있는 호모게네이트 제제에서 ATPases 또는 기타 세포형 생화학물질의 존재가 존재하며 추가 적인 교정 방법 또는 억제제 사용이 필요할 수 있다33 및 3) 샘플당 많은 샘플 및/또는 여러 SUIT의 평가는 한 번에 두 개의 실험을 수용할 수 있으며 연속적인 실험 사이에 정리및 설정이 필요하기 때문에 시간이 많이 소요됩니다. 최적화 실험과 일관된 샘플 준비는 일관성 없는 데이터에 기여하는 상당한 미토콘드리아 손상을 최소화할 수 있습니다.
기존/대체 방법에 대하여 방법의 중요성은 개시 물질의 양, 미토콘드리아 분리의 도전 또는 투과 조직에 있는 기술적인 도전의 양에 비해 향상된 타당성입니다. 균질화의 준비는 더 빠르며, 산소는 거의 제한되지 않으며, 투과 조직에 비해 인력 간의 가변성에 덜 취약합니다. 중요한 것은, 거의 모든 견본 모형은 조직에 걸쳐 비교 분석을 허용하는 호모전 준비에 적합합니다. 고해상도 호흡법은 미토콘드리아 OXPHOS 및 ET의 금 표준 측정입니다. 전임상 및 임상암 연구에서 이 방법의 적용은 생체 내 연구를 전생체 연구로 확대할 수 있는 능력을 가지고 있다. 또한 임상 및 진단 설정에서 잠재적인 응용 프로그램을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 동물 치료를위한 페닝턴 생물 의학 연구 센터 비교 생물학 핵심 직원에게 감사드립니다. 이 연구는 건강의 국가 학회보조금 U54GM104940 (JPK) 및 KL2TR003097 (LAG)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 동물과 관련된 모든 실험과 절차는 페닝턴 생물 의학 연구 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4544 | |
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free | Sigma-Aldrich | 3117057001 | Roche |
BD 50 mL Luer-Lok Syringe | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C2506 | |
Datlab 7.4 software | Oroboros Instruments | ||
Dimethylsulfoxide | Amresco | N182 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Dumoxel, autoclavable |
Dumont # 7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumoxel, autoclavable |
Digital Calipers 150 mm/6 in | World Precision Instruments | 501601 | |
EO771 cells | CH3 BioSystems | SKU: 94APV1-vial-prem | Pathogen Tested |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Stock #000664 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 34120 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | L2398 | |
Malate | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Matrigel Matrix | Corning | 354248 | |
MgCl·6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Microsyringes | Hamilton | 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943 | |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | |
Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10023-03 | |
Oxygraph-2k FluoRespirometer | Oroboros Instruments | 10003-01 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875034 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Succinate (disodium) | Sigma-Aldrich | W327700 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Whatman Filter Paper, grade 5 | Sigma-Aldrich | 1005-090 | |
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL | Duran Wheaton Kimble | 357424 | |
Straight Tip Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5914SC | |
Non-Safety Scalpel No. 11 | McKesson | 1029065 | |
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 | Becton, Dickinson and Company | 305109 | |
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 | Becton, Dickinson and Company | 305195 | |
BD 1mL Slip Tip Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 316060 | |
Rodent Very High Fat Diet, 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate | Research Diet | D12492 | |
Pyrex Watch Glass, 100 mm | Thermo Fisher Scientific | S34819 |