Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli
Summary
Meme kanseri beyin metastatik hücrelerinin gerçek zamanlı ilaç ve radyasyon yanıtını ölçmek için organotipik bir beyin dilimi modelinde bir protokol sunuyoruz. Yöntemler, çeşitli tedavilerin meme kanserinden beyin metastazları üzerindeki terapötik etkilerini, beyin mikroçevre arayüzü içinde ex vivo bir şekilde araştırmak için nicel bir test sağlar.
Abstract
Beyin metastazı, kadınlar için meme kanserinin ciddi bir sonucudur, çünkü bu tümörlerin tedavisi zordur ve kötü klinik sonuçlarla ilişkilidir. Meme kanseri beyin metastatik (BCBM) büyümesinin klinik öncesi fare modelleri yararlıdır, ancak pahalıdır ve beyin parankimi içindeki canlı hücreleri ve tümör hücresi invazyonunu izlemek zordur. Burada, intrakraniyal olarak enjekte edilen meme kanseri beyin arayan klonal alt hatları içeren ksenograflanmış farelerden ex vivo beyin dilimi kültürleri için bir protokol sunulmaktadır. MDA-MB-231BR lusiferaz etiketli hücreler, Nu/Nu dişi farelerin beyinlerine intrakraniyal olarak enjekte edildi ve tümör oluşumunu takiben, beyinler izole edildi, dilimlendi ve ex vivo kültüre alındı. Tümör dilimleri, lusiferaz eksprese eden tümör hücrelerini tanımlamak ve beyin parankimindeki proliferasyonlarını ve istilalarını 10 güne kadar izlemek için görüntülendi. Ayrıca, protokol, iyonlaştırıcı radyasyon veya kemoterapi ile tedaviyi takiben tümör hücrelerinin büyümesini ve invaziv davranışını görüntülemek için hızlandırılmış mikroskopinin kullanımını açıklar. Tümör hücrelerinin tedavilere yanıtı, canlı görüntüleme mikroskopisi, biyolüminesans yoğunluğunun ölçülmesi ve BCBM hücrelerini içeren beyin dilimi üzerinde histoloji yapılması ile görselleştirilebilir. Bu nedenle, bu ex vivo dilim modeli, bireysel bir hastanın meme kanseri beyin metastatik büyümesini beyin mikro ortamında hedeflemek üzere kişiselleştirilmiş ilaçları tanımlamak için tek başına veya radyasyonla kombinasyon halinde yeni terapötik ajanların hızlı bir şekilde test edilmesi için yararlı bir platform olabilir.
Introduction
Meme kanseri beyin metastazları (BCBM), hücreler birincil meme tümöründen beyne yayıldığında gelişir. Meme kanseri, akciğer kanserinden sonra beyin metastazının ikinci en sık nedenidir ve metastazlar hastaların %10-16’sında görülür1. Ne yazık ki, beyin metastazları, hastaların %>80’i beyin metastazı tanısından sonraki bir yıl içinde öldüğü ve nörolojik işlev bozuklukları nedeniyle yaşam kalitelerinin bozulduğu için tedavi edilemez olmaya devam etmektedir2. Daha etkili tedavi seçeneklerinin belirlenmesi için acil bir ihtiyaç vardır. Tek katmanlı iki boyutlu veya üç boyutlu kültür modelleri, terapötik ajanların laboratuvarda test edilmesinde en sık kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, tümör fenotipinin ve büyümesinin önemli bir itici gücü olan karmaşık BCBM mikro ortamını taklit etmezler. Bu modeller yararlı olmasına rağmen, karmaşık tümör-stromal etkileşimleri, benzersiz metabolik gereksinimleri ve tümörlerin heterojenliğini yakalamaz3. Tümör-stromal etkileşimleri ve mikroçevre heterojenliğini daha sadık bir şekilde özetlemek için, grubumuz ve diğerleri, hasta kaynaklı tümör hücreleri (birincil veya metastatik) veya kanser hücresi hatları 4,5,6 ile organotipik beyin metastazı “dilim” kültürleri üretmeye başlamıştır. Klasik in vitro sistemlerle karşılaştırıldığında, bu kısa süreli ex vivo model, büyük hayvan kohortlarında klinik öncesi değerlendirmeden önce yeni terapötiklerin taranması için daha uygun koşullar sağlayabilir.
Ex vivo modelleri, öncelikle çeşitli kanserlerin başarılı tedavilerinin tanımlanması için inşa edilmiş ve başarıyla kullanılmıştır. Birkaç günlük değerlendirme gerektirirler ve ayrıca hastaya özgü ilaç taramasına uyarlanabilirler. Örneğin, insan mesane ve prostat kanseri ex vivo dokuları, dosetaksel ve gemsitabin7’nin doza bağımlı bir anti-tümör yanıtı göstermiştir. Kemoterapötik ilaçlar Oxaliplatin, Cetuximab ve Pembrolizumab8’i taramak için benzer kolorektal karsinom ex vivo dokular geliştirilmiştir. Bu uygulama pankreas kanserinde, pankreatik duktal adenokarsinomun stromal ortamı ile genotipik ve fenotipik özellikleri arasındaki temel etkileşim göz önüne alındığında yaygın olarak kullanılmaktadır 9,10. Ayrıca, baş, boyun, gastrik ve meme tümörlerinde benzer taramalar için bu tür organotipik modeller geliştirilmiştir11,12.
Burada, mikro-ortamlarındaki ksenograflanmış meme kanseri beyin metastatik tümör hücrelerinin ex vivo beyin dilim modeli üretilmektedir. Farelere, TNBC metastazı 14,15’in ortak bir bölgesi olan serebral korteks parietal lobunda meme kanseri beyin metastatik beyin trofik MDA-MB-231BR hücreleri 13 ile intrakraniyal olarak enjekte edildi ve tümörlerin gelişmesine izin verildi. Beyin dilimleri bu ksenograflanmış hayvanlardan üretildi ve 16,17’de tanımlandığı gibi organotipik kültürler olarak ex vivo tutuldu. Bu yeni ex vivo model, BCBM hücresinin beyin parankimi içindeki büyümesinin analizine izin verir ve beyin mikro ortamındaki tümör hücreleri üzerindeki terapötik ajanları ve radyasyon etkilerini test etmek için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, ekşik ksenogreft beyin tümörleri için yeni bir ex vivo beyin kültürü yöntemi ortaya koymaktadır. Farelerin beynine intrakraniyal olarak enjekte edilen BCBM hücreleri MDA-MB-231BR hücrelerinin ex vivo beyin dilimlerinde hayatta kalabileceğini ve büyüyebileceğini gösteriyoruz. Çalışma ayrıca intrakraniyal olarak enjekte edilen U87MG glioblastoma (GBM) hücrelerini test etti ve ayrıca bu kanser hücrelerinin beyin dilimlerinde hayatta kaldığını ve büyüdüğünü bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik yardımları için Julia Farnan, Kayla Green ve Tiziana DeAngelis’e teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma kısmen Pennsylvania Commonwealth Evrensel Araştırma Geliştirme Hibe Programı (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) ve W.W. Smith Charitable Trusts (EjH) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel’s mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice–a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
