מודל פרוסת מוח Ex Vivo כדי לחקור ולמקד את צמיחת הגידול הגרורתי של סרטן השד במוח
Summary
אנו מציגים פרוטוקול למדידת תגובת תרופות וקרינה בזמן אמת של תאים גרורתיים במוח של סרטן השד במודל פרוסת מוח אורגנוטיפית. השיטות מספקות בדיקה כמותית כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות של טיפולים שונים על גרורות במוח מסרטן השד באופן ex vivo בתוך ממשק המיקרו-סביבה של המוח.
Abstract
גרורות במוח הן תוצאה חמורה של סרטן השד עבור נשים מכיוון שגידולים אלה קשים לטיפול וקשורים לתוצאות קליניות גרועות. מודלים פרה-קליניים של עכברים של גדילה גרורתית של סרטן השד במוח (BCBM) הם שימושיים אך הם יקרים, וקשה לעקוב אחר תאים חיים ופלישה של תאי גידול בתוך הפרנכימה המוחית. מוצג כאן פרוטוקול לתרביות פרוסות מוח ex vivo מעכברים עם קסנוגרפט המכילים תתי-שורות קלונליות תוך גולגולתיות של סרטן שד מוזרקות באופן תוך גולגולתי. תאים מתויגים של MDA-MB-231BR luciferase הוזרקו באופן תוך גולגולתי לתוך מוחם של עכברי נקבות Nu/Nu, ובעקבות היווצרות הגידול, המוחות בודדו, נחתכו ותרביתו ex vivo. פרוסות הגידול צולמו כדי לזהות תאים סרטניים המבטאים לוציפראז ולנטר את התפשטותם ופלישתם בפרנכימה המוחית במשך עד 10 ימים. יתר על כן, הפרוטוקול מתאר את השימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן כדי לדמות את הצמיחה וההתנהגות הפולשנית של תאי הגידול לאחר הטיפול בקרינה מייננת או בכימותרפיה. ניתן לדמיין את התגובה של תאי הגידול לטיפולים על ידי מיקרוסקופיה של הדמיה חיה, מדידת עוצמת הביולומינסנציה וביצוע היסטולוגיה על פרוסת המוח המכילה תאי BCBM. לפיכך, מודל פרוסת ex vivo זה עשוי להיות פלטפורמה שימושית לבדיקה מהירה של חומרים טיפוליים חדשניים בלבד או בשילוב עם קרינה כדי לזהות תרופות המותאמות אישית כדי להתמקד בצמיחה גרורתית של סרטן השד של מטופלת בודדת בתוך המיקרו-סביבה במוח.
Introduction
גרורות במוח של סרטן השד (BCBM) מתפתחות כאשר תאים מתפשטים מגידול השד הראשוני למוח. סרטן השד הוא הגורם השני בשכיחותו לגרורות במוח לאחר סרטן הריאות, כאשר גרורות מתרחשות אצל 10-16% מהחולות1. למרבה הצער, גרורות במוח עדיין חשוכות מרפא מכיוון >80% מהחולים מתים תוך שנה לאחר אבחון גרורות במוח, ואיכות חייהם נפגעת עקב תפקוד נוירולוגי2. יש צורך דחוף לזהות אפשרויות טיפול יעילות יותר. מודלים דו-ממדיים או תלת-ממדיים של תרביות חד-ממדיות הם השיטות הנפוצות ביותר בבדיקת חומרים טיפוליים במעבדה. עם זאת, הם אינם מחקים את המיקרו-סביבה המורכבת של BCBM, גורם עיקרי לפנוטיפ הגידול ולצמיחה. למרות שמודלים אלה שימושיים, הם אינם לוכדים את האינטראקציות המורכבות בין הגידול לסטרומל, את הדרישות המטבוליות הייחודיות ואת ההטרוגניות של הגידולים3. כדי לשחזר באופן נאמן יותר את האינטראקציות בין הגידול לסטרומל ואת ההטרוגניות של המיקרו-סביבה, הקבוצה שלנו ואחרים החלו ליצור תרביות “פרוסות” של גרורות מוחיות אורגנוטיפיות עם תאי גידול שמקורם בחולה (ראשוניים או גרורתיים) או קווי תאים סרטניים 4,5,6. בהשוואה למערכות מבחנה קלאסיות, מודל ex vivo קצר טווח זה עשוי לספק תנאים רלוונטיים יותר לבדיקת טיפולים חדשים לפני הערכה פרה-קלינית בקבוצות גדולות של בעלי חיים.
מודלים של Ex vivo נבנו ושימשו בהצלחה בעיקר לזיהוי טיפולים מוצלחים בסוגי סרטן שונים. הם דורשים כמה ימים של הערכה ובנוסף ניתן להתאים אותם לבדיקת תרופות ספציפיות למטופל. לדוגמה, רקמות ex vivo של שלפוחית השתן והערמונית האנושיות הראו תגובה אנטי-סרטנית תלוית מינון של דוקטקסל וגמציטאבין7. רקמות קרצינומה מעי גס דומות ex vivo פותחו כדי לסנן תרופות כימותרפיות Oxaliplatin, Cetuximab, ו Pembrolizumab8. יישום זה נמצא בשימוש נרחב בסרטן הלבלב, בהתחשב באינטראקציה החיונית בין הסביבה הסטרומלית לבין המאפיינים הגנוטיפיים והפנוטיפיים של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב 9,10. יתר על כן, מודלים אורגנוטיפיים כאלה פותחו עבור בדיקות דומות בגידולי ראש, צוואר, קיבה ושד11,12.
כאן נוצר מודל פרוסת מוח ex vivo של תאי גידול גרורתיים של סרטן שד קסנוגרטיבי במוח במיקרו-סביבה שלהם. עכברים הוזרקו להם באופן תוך גולגולתי תאי MDA-MB-231BR טרופיים של סרטן השד במוח, 13 באונה הקודקודית של קליפת המוח – אתר נפוץ של גרורות TNBC14,15 והותר להם לפתח גידולים. פרוסות מוח נוצרו מחיות קסנוגרות אלה ושמרו על ex vivo כתרביות אורגנוטיפיות כמתואר16,17. מודל ex vivo חדשני זה מאפשר ניתוח של גדילת תאי BCBM בתוך הפרנכימה המוחית וניתן להשתמש בו כדי לבחון חומרים טיפוליים והשפעות קרינה על תאי הגידול בתוך המיקרו-סביבה של המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מבסס שיטה חדשנית של תרבית מוח ex vivo עבור גידולי מוח של קסנוגרפט מוסברים. אנו מראים שתאי BCBM MDA-MB-231BR המוזרקים באופן תוך גולגולתי במוחם של עכברים יכולים לשרוד ולגדול בפרוסות מוח ex vivo . המחקר בחן גם תאי גליובלסטומה תוך גולגולתית מסוג U87MG (GBM) שהוזרקו להם, וגם מצא שתאים סרטניים אלה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לג’וליה פרנאן, קיילה גרין וטיזיאנה דה-אנג’ליס על הסיוע הטכני שלהן. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תוכנית המענקים לשיפור המחקר האוניברסלי של חבר העמים של פנסילבניה (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) ו- W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel’s mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice–a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
