نموذج شريحة الدماغ خارج الجسم الحي لدراسة واستهداف سرطان الثدي نمو الورم النقيلي في الدماغ
Summary
نحن نقدم بروتوكولا لقياس الاستجابة الدوائية والإشعاعية في الوقت الحقيقي لخلايا الدماغ النقيلية لسرطان الثدي في نموذج شريحة الدماغ العضوية النمطية. توفر الطرق فحصا كميا للتحقيق في الآثار العلاجية للعلاجات المختلفة على نقائل الدماغ من سرطان الثدي بطريقة خارج الجسم الحي داخل واجهة البيئة الدقيقة للدماغ.
Abstract
ورم خبيث في الدماغ هو نتيجة خطيرة لسرطان الثدي للنساء حيث يصعب علاج هذه الأورام وترتبط بنتائج سريرية سيئة. نماذج الفئران قبل السريرية لسرطان الثدي نمو الدماغ النقيلي (BCBM) مفيدة ولكنها باهظة الثمن ، ومن الصعب تتبع الخلايا الحية وغزو الخلايا السرطانية داخل حمة الدماغ. يظهر هنا بروتوكول لمزارع شرائح الدماغ خارج الجسم الحي من الفئران المطعمة بالأجانب التي تحتوي على خطوط فرعية نسلية لسرطان الثدي عن طريق الحقن داخل الجمجمة. تم حقن الخلايا الموسومة ب MDA-MB-231BR luciferase داخل الجمجمة في أدمغة الفئران الإناث Nu / Nu ، وبعد تكوين الورم ، تم عزل الأدمغة وتقطيعها وزراعتها خارج الجسم الحي. تم تصوير شرائح الورم لتحديد الخلايا السرطانية التي تعبر عن luciferase ومراقبة انتشارها وغزوها في حمة الدماغ لمدة تصل إلى 10 أيام. علاوة على ذلك ، يصف البروتوكول استخدام المجهر بفاصل زمني لتصوير النمو والسلوك الغازي للخلايا السرطانية بعد العلاج بالإشعاع المؤين أو العلاج الكيميائي. يمكن تصور استجابة الخلايا السرطانية للعلاجات عن طريق التصوير المجهري الحي ، وقياس شدة التلألؤ الحيوي ، وإجراء علم الأنسجة على شريحة الدماغ التي تحتوي على خلايا BCBM. وبالتالي ، قد يكون نموذج شريحة خارج الجسم الحي هذا منصة مفيدة للاختبار السريع للعوامل العلاجية الجديدة بمفردها أو بالاشتراك مع الإشعاع لتحديد الأدوية المخصصة لاستهداف نمو الدماغ النقيلي لسرطان الثدي لدى المريض داخل البيئة الدقيقة للدماغ.
Introduction
تتطور نقائل الدماغ لسرطان الثدي (BCBM) عندما تنتشر الخلايا من ورم الثدي الأساسي إلى الدماغ. سرطان الثدي هو السبب الثاني الأكثر شيوعا لانبثاث الدماغ بعد سرطان الرئة ، مع حدوث النقائل في 10-16 ٪ من المرضى1. لسوء الحظ ، تظل النقائل الدماغية غير قابلة للشفاء حيث يموت >80٪ من المرضى في غضون عام بعد تشخيص ورم خبيث في الدماغ ، وتضعف نوعية حياتهم بسبب الاختلالات العصبية2. هناك حاجة ملحة لتحديد خيارات علاج أكثر فعالية. نماذج الثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد هي الطرق الأكثر استخداما في اختبار العوامل العلاجية في المختبر. ومع ذلك ، فإنها لا تحاكي البيئة الدقيقة BCBM المعقدة ، وهي محرك رئيسي للنمط الظاهري للورم ونموه. على الرغم من أن هذه النماذج مفيدة ، إلا أنها لا تلتقط التفاعلات المعقدة بين الورم واللحمية ، ومتطلبات التمثيل الغذائي الفريدة ، وعدم تجانس الأورام3. لتلخيص التفاعلات بين الورم واللحمية وعدم تجانس البيئة الدقيقة بشكل أكثر إخلاصا ، بدأت مجموعتنا وغيرها في توليد ثقافات “شرائح” خبيثة في الدماغ العضوي مع الخلايا السرطانية المشتقة من المريض (الأولية أو النقيلية) أو خطوط الخلايا السرطانية4،5،6. بالمقارنة مع الأنظمة المختبرية الكلاسيكية ، قد يوفر هذا النموذج خارج الجسم الحي قصير الأجل ظروفا أكثر ملاءمة لفحص العلاجات الجديدة قبل التقييم قبل السريري في مجموعات الحيوانات الكبيرة.
تم بناء نماذج خارج الجسم الحي واستخدامها بنجاح في المقام الأول لتحديد العلاجات الناجحة لمختلف أنواع السرطان. وهي تتطلب بضعة أيام من التقييم ويمكن بالإضافة إلى ذلك أن تكون مصممة خصيصا لفحص الأدوية الخاصة بالمريض. على سبيل المثال ، أظهرت أنسجة المثانة وسرطان البروستاتا البشري خارج الجسم الحي استجابة مضادة للورم تعتمد على الجرعة من دوسيتاكسيل وجيمسيتابين7. تم تطوير سرطان القولون والمستقيم المماثل خارج أنسجة الجسم الحي لفحص أدوية العلاج الكيميائي Oxaliplatin و Cetuximab و Pembrolizumab8. وقد استخدم هذا التطبيق على نطاق واسع في سرطان البنكرياس، مع الأخذ في الاعتبار التفاعل الأساسي بين البيئة اللحمية والخصائص الجينية والنمط الظاهري للسرطان الغدي الأقنوي البنكرياس 9,10. علاوة على ذلك ، تم تطوير مثل هذه النماذج العضوية لإجراء فحوصات مماثلة في أورام الرأس والرقبة والمعدة والثدي11,12.
هنا ، يتم إنشاء نموذج شريحة دماغية خارج الجسم الحي من الخلايا السرطانية النقيلية لسرطان الثدي في بيئتها الدقيقة. تم حقن الفئران داخل الجمجمة مع سرطان الثدي الدماغ النقيلي الدماغ التغذية MDA-MB-231BR الخلايا13 في الفص الجداري القشرة الدماغية – وهو موقع شائع من TNBC ورم خبيث14,15 وسمح لتطوير الأورام. تم توليد شرائح الدماغ من هذه الحيوانات المطعمة بالأجانب وحافظت عليها خارج الجسم الحي كثقافات عضوية كما هو موضحفي 16,17. يسمح هذا النموذج الجديد خارج الجسم الحي بتحليل نمو خلية BCBM داخل حمة الدماغ ويمكن استخدامه لاختبار العوامل العلاجية والتأثيرات الإشعاعية على الخلايا السرطانية داخل البيئة الدقيقة للدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
تؤسس هذه الدراسة طريقة جديدة لزراعة الدماغ خارج الجسم الحي لأورام الدماغ xenograft المزروعة. نظهر أن خلايا BCBM MDA-MB-231BR التي يتم حقنها داخل الجمجمة في دماغ الفئران يمكن أن تبقى على قيد الحياة وتنمو في شرائح الدماغ خارج الجسم الحي . اختبرت الدراسة أيضا خلايا الورم الأرومي الدبقي U87MG (GBM) ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر جوليا فارنان وكايلا غرين وتيزيانا دي أنجليس على مساعدتهم التقنية. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل برنامج منح تعزيز البحوث العالمي في الكومنولث في بنسلفانيا (MJR ، JGJ) ، UO1CA244303 (MJR) ، R01CA227479 (NLS) ، R00CA207855 (EJH) ، و W.W. Smith Charity Trusts (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel’s mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice–a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
