Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno
Summary
Introduciamo un protocollo per misurare in tempo reale la risposta ai farmaci e alle radiazioni delle cellule metastatiche cerebrali del cancro al seno in un modello organotipico di fetta di cervello. I metodi forniscono un test quantitativo per studiare gli effetti terapeutici di vari trattamenti sulle metastasi cerebrali da cancro al seno in modo ex vivo all’interno dell’interfaccia del microambiente cerebrale.
Abstract
Le metastasi cerebrali sono una grave conseguenza del cancro al seno per le donne in quanto questi tumori sono difficili da trattare e sono associati a scarsi risultati clinici. I modelli murini preclinici di crescita metastatica cerebrale del cancro al seno (BCBM) sono utili ma sono costosi ed è difficile tracciare le cellule vive e l’invasione delle cellule tumorali all’interno del parenchima cerebrale. Qui viene presentato un protocollo per colture di fette di cervello ex vivo da topi xenografati contenenti sottolinee clonali di ricerca cerebrale per cancro al seno iniettato intracranicamente. Le cellule marcate con luciferasi MDA-MB-231BR sono state iniettate intracranicamente nel cervello dei topi femmina Nu / Nu e, dopo la formazione del tumore, i cervelli sono stati isolati, affettati e coltivati ex vivo. Le fette tumorali sono state fotografate per identificare le cellule tumorali che esprimono luciferasi e monitorare la loro proliferazione e invasione nel parenchima cerebrale per un massimo di 10 giorni. Inoltre, il protocollo descrive l’uso della microscopia time-lapse per visualizzare la crescita e il comportamento invasivo delle cellule tumorali dopo il trattamento con radiazioni ionizzanti o chemioterapia. La risposta delle cellule tumorali ai trattamenti può essere visualizzata mediante microscopia live-imaging, misurando l’intensità della bioluminescenza ed eseguendo l’istologia sulla fetta di cervello contenente cellule BCBM. Pertanto, questo modello di slice ex vivo può essere una piattaforma utile per la sperimentazione rapida di nuovi agenti terapeutici da soli o in combinazione con radiazioni per identificare farmaci personalizzati per indirizzare la crescita metastatica del cervello del cancro al seno di un singolo paziente all’interno del microambiente cerebrale.
Introduction
Le metastasi cerebrali del cancro al seno (BCBM) si sviluppano quando le cellule si diffondono dal tumore mammario primario al cervello. Il cancro al seno è la seconda causa più frequente di metastasi cerebrali dopo il cancro del polmone, con metastasi che si verificano nel 10-16% dei pazienti1. Sfortunatamente, le metastasi cerebrali rimangono incurabili poiché >80% dei pazienti muore entro un anno dalla diagnosi di metastasi cerebrali e la loro qualità di vita è compromessa a causa di disfunzioni neurologiche2. C’è un urgente bisogno di identificare opzioni di trattamento più efficaci. I modelli di coltura monostrato bidimensionali o tridimensionali sono i metodi più comunemente usati per testare gli agenti terapeutici in laboratorio. Tuttavia, non imitano il complesso microambiente BCBM, uno dei principali driver del fenotipo tumorale e della crescita. Sebbene questi modelli siano utili, non catturano le complesse interazioni tumore-stromale, i requisiti metabolici unici e l’eterogeneità dei tumori3. Per ricapitolare più fedelmente le interazioni tumore-stromale e l’eterogeneità del microambiente, il nostro gruppo e altri hanno iniziato a generare metastasi cerebrali organotipiche “slice” colture con cellule tumorali derivate dal paziente (primarie o metastatiche) o linee cellulari tumorali 4,5,6. Rispetto ai sistemi classici in vitro, questo modello ex vivo a breve termine può fornire condizioni più rilevanti per lo screening di nuove terapie prima della valutazione preclinica in grandi coorti di animali.
Modelli ex vivo sono stati costruiti e utilizzati con successo principalmente per l’identificazione di trattamenti di successo di vari tumori. Richiedono alcuni giorni di valutazione e inoltre possono essere adattati allo screening farmacologico specifico del paziente. Ad esempio, i tessuti ex vivo del cancro della vescica e della prostata umano hanno mostrato una risposta antitumorale dose-dipendente di docetaxel e gemcitabina7. Simili tessuti di carcinoma colorettale ex vivo sono stati sviluppati per lo screening dei farmaci chemioterapici Oxaliplatino, Cetuximab e Pembrolizumab8. Questa applicazione è stata ampiamente utilizzata nel cancro del pancreas, considerando l’interazione essenziale tra l’ambiente stromale e le caratteristiche genotipiche e fenotipiche dell’adenocarcinoma duttale pancreatico 9,10. Inoltre, tali modelli organotipici sono stati sviluppati per screening simili nei tumori della testa, del collo, gastrici e della mammella11,12.
Qui, viene generato un modello ex vivo di fette di cervello di cellule tumorali metastatiche cerebrali xenografate del cancro al seno nel loro microambiente. I topi sono stati iniettati intracranicamente con carcinoma mammario cerebrale metastatico trofico mdA-MB-231BR cellule13 nel lobo parietale della corteccia cerebrale – un sito comune di metastasi TNBC14,15 e permesso di sviluppare tumori. Le fette di cervello sono state generate da questi animali xenografati e mantenute ex vivo come colture organotipiche come descritto16,17. Questo nuovo modello ex vivo consente l’analisi della crescita delle cellule BCBM all’interno del parenchima cerebrale e può essere utilizzato per testare agenti terapeutici ed effetti delle radiazioni sulle cellule tumorali all’interno del microambiente cerebrale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio stabilisce un nuovo metodo di coltura cerebrale ex vivo per i tumori cerebrali allo xenotrapianto espiantato. Mostriamo che le cellule BCBM MDA-MB-231BR iniettate intracranicamente nel cervello dei topi possono sopravvivere e crescere in fette di cervello ex vivo . Lo studio ha anche testato le cellule di glioblastoma U87MG iniettate intracranicamente (GBM) e ha anche scoperto che queste cellule tumorali sopravvivono e crescono in fette di cervello (dati non mostrati). Riteniamo che questo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vogliamo ringraziare Julia Farnan, Kayla Green e Tiziana DeAngelis per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato in parte dal Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) e W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
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