Este artigo tem como objetivo fornecer um protocolo para o isolamento e cultura de fibroblastos primários associados ao câncer a partir de um modelo de murina síngênica de câncer de mama triplo-negativo e sua aplicação para o estudo pré-clínico de novas nanopartículas projetadas para atingir o microambiente tumoral.
Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são atores-chave no contexto do microambiente tumoral. Apesar de ter sido reduzido em número em comparação com as células tumorais, os CAFs regulam a progressão do tumor e fornecem proteção contra imunidade antitumoral. Estratégias anticancerígenas emergentes visam remodelar o microambiente tumoral através da ablação de CAFs pró-tumorigênicos ou reprogramação das funções dos CAFs e seu status de ativação. Uma abordagem promissora é o desenvolvimento de agentes de entrega nanosized capazes de atingir CAFs, permitindo assim a entrega específica de medicamentos e moléculas ativas. Neste contexto, um modelo celular de CAFs pode fornecer uma ferramenta útil para triagem in vitro e investigação preliminar de tais nanoformulações.
Este estudo descreve o isolamento e a cultura dos CAFs primários do modelo síngênico 4T1 murine de câncer de mama triplo-negativo. Contas magnéticas foram usadas em um processo de separação em 2 etapas para extrair CAFs de tumores dissociados. O controle de imunofenofoteping foi realizado utilizando-se a citometria de fluxo após cada passagem para verificar o rendimento do processo. CaFs isolados podem ser empregados para estudar a capacidade de segmentação de diferentes nanoformulações projetadas para combater o microambiente tumoral. Nanocages de H-ferritin fluorescentes foram usadas como nanopartículas candidatas para configurar o método. Nanopartículas, nuas ou conjugadas com ligante de alvo, foram analisadas para sua vinculação aos CAFs. Os resultados sugerem que a extração ex vivo de CAFs mamários pode ser um sistema útil para testar e validar nanopartículas para o direcionamento específico de CAFs tumorigênicos.
Durante as últimas décadas, ficou claro que matar células tumorais geralmente não é suficiente para erradicar a malignidade, pois o microambiente tumoral pode provocar recaída tumoral e induzir resistência terapêutica1,2. Em seguida, surgiu um novo paradigma: direcionar o estroma tumoral para privar o tumor de fatores de apoio e, assim, aumentar a eficácia da quimioterápica3,4,5. Em particular, os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) são um alvo estromacal interessante em muitos tumores sólidos6,7. Os CAFs são um grupo muito heterogêneo de células que interagem com células cancerosas e células do sistema imunológico através da secreção de fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas; construir e remodelar a matriz extracelular; e permitir a formação de metástase8,9,10,11,12. Dependendo do tipo de tumor, os CAFs apresentam funções pró-tumorigênicas, enquanto outros subtipos de CAFs parecem ter funções supressivas de tumor13,14. Para esclarecer melhor essa dicotomia, é importante uma caracterização completa dos CAFs de tumores primários e metastáticos.
Nesse contexto, um campo emergente de pesquisa tem focado no desenvolvimento de agentes nanosized projetados para atingir e/ou destruir CAFs, fornecendo moléculas ativas e drogas capazes de remodelar o microambiente tumoral15,16,17,18. Vários tipos de nanopartículas foram projetadas para alcançar a ablação do CAF por meio de drogas citotóxiximicas, para induzir a terapia fotodinâmica direcionada ao CAF, ou para reprogramar CAFs revertendo-os para um estado quiescente ou induzindo a apoptose induzida pela TNF, expressão de ligante induzida pela Apoptose, que induz a apoptose das células cancerígenas vizinhas16,19. Além disso, o potencial de muitas nanopartículas para atingir ativamente marcadores biológicos específicos dá origem à esperança de selecionar subconjuntos da CAF para atingir. Embora sua especificidade absoluta para o CAF ainda seja questionada, a proteína de ativação do fibroblasto (FAP) é um dos alvos mais promissores do estroma pró-tumorigênico e é explorada para orientar a entrega de nanodrogas, pavimentando assim o caminho para o desenvolvimento da nanoterapêutica direcionada ao CAF20,21,22.
Este artigo descreve o isolamento dos CAFs primários de um modelo síngênico de câncer de mama murina e relata seu uso no estudo da capacidade de segmentação de nanopartículas projetadas para reconhecer o marcador CAF, FAP. As nanocagens de ferritina são usadas como nanosistemas candidatos para configurar o método, pois sua especificidade de entrega pode ser moldada pela exposição superficial de moieties de alvo23,24. Além disso, os ferritins têm sido comprovados com sucesso como excelentes transportes biocompatíveis para aplicações antitumorais, desencadeando o rápido acúmulo da carga na massa tumoral25,26,27. Até o momento, estudos pré-clínicos de nanosistemas direcionados ao CAF envolveram testes in vitro em linhas celulares de fibroblasto estimulados na cultura com a transformação do fator de crescimento-beta para induzir a ativação celular e a expressão de algumas características imunofenópicas dos CAFs28,29. Este método é geralmente aplicado a linhas celulares imortalizadas (como NIH3T3, LX-2) e é bastante rápido e simples, produzindo células ativadas em poucas horas ou dias. Uma limitação é que, embora a estimulação in vitro induz a expressão de alguns genes atribuídos a miofibroblasts ativados, não pode recapitular inteiramente todas as características biológicas dos CAFs reais, especialmente sua heterogeneidade in vivo.
Outra estratégia envolve a extração de CAFs primários de amostras de tumor humanos ou camundongos30,31. Isso garante que a ativação do CAF ocorra em um contexto fisiológico, e que a heterogeneidade das subpopulações do CAF seja mantida. De acordo com o objetivo da pesquisa, os CAFs podem ser derivados de diferentes fontes, oferecendo assim a possibilidade de estudar a condição mais confiável. O protocolo aqui relatado seria valioso para cientistas que buscam realizar uma avaliação preliminar da funcionalidade de novas nanopartículas projetadas para atingir CAFs de um modelo de câncer de mama murina. CAFs isolados seriam úteis para o rastreamento dessas nanopartículas que são promissoras o suficiente para proceder à avaliação in vivo em modelos animais de câncer. Isso será relevante durante os primeiros passos da produção de nanopartículas, levando os nanotecnólogos para o refinamento do design de nanopartículas, considerando principalmente a estratégia de imobilização de ligantes e para alcançar propriedades de mira ideais.
Os CAFs estão emergindo como atores-chave na remodelação da matriz extracelular, promovendo a progressão da metástase e limitando o acesso de medicamentos ao local do tumor34. No entanto, devido à sua heterogeneidade, seus papéis ainda são controversos — alguns CAFs são tumorigênicos, enquanto alguns outros subtipos parecem ter um papel supressivo do tumor. Nesse contexto, seu isolamento pode ser de extremo interesse para lançar mais luz sobre seu tão debatido papel na progressão do câncer, que terá importantes implicações clínicas12,31. Além disso, a extração bem-sucedida do CAF a partir de modelos de tumor de camundongos humanos e pré-clínicos também facilitaria o desenvolvimento de novos medicamentos direcionados ao CAF. Este artigo relata um método para isolar e cultivar eficientemente cafs primários de um modelo pré-clínico sintônico de câncer de mama. Com base na experiência, três etapas experimentais influenciam principalmente o sucesso do protocolo.
O primeiro está trabalhando rápido para evitar a agregação de suspensões celulares associadas ao risco de coagulação na coluna e efflux celular lento: na verdade, quando as células que passavam pela coluna foram agrupadas, a probabilidade de um processo de isolamento sub-ideal aumentou, e as culturas finais continham clones celulares “contaminantes”. A segunda é a junção de células de diferentes tumores após a passagem de esgotamento para garantir que células suficientes sejam passadas na etapa final de enriquecimento. A questão crítica final é emplacar as células extraídas em altas densidades celulares, provavelmente a partir de um único poço da placa de 24 poços para impulsionar o crescimento celular e a expansão da colônia para até 4-5 passagens. Se as células foram semeadas em baixas densidades, elas se expandiram na superfície livre e rapidamente pararam de se replicar.
Vários estudos já descreveram métodos de extração de CAF de origem humana e camundongo, para estudar seu papel na promoção do desenvolvimento do câncer e da invasividade. Isso tem sido feito em muitos tipos de tumores, incluindo câncer de mama, melanoma, colangiocarcinoma e adenocarcinoma pancreático35,36,37,38. No entanto, devido à falta de marcadores específicos do CAF e à sua heterogeneidade, os resultados desses processos ainda são sub-ideais.
Aqui, as células isoladas foram utilizadas para validar a capacidade de direcionamento do CAF de nanocálgenas HFn funcionalizadas com moieties anti-FAP. O uso de culturas primárias de CAFs foi uma vantagem significativa, permitindo a validação da nanostrategy ex vivo com um experimento de ligação muito mais simples e econômico do que fazê-lo diretamente in vivo nesta fase preliminar de otimização de nanodrogas.
Nesse sentido, testes ex vivo em CAFs podem preceder experimentos in vivo animal, permitindo a triagem e seleção das nanopartículas mais promissoras para o direcionamento ideal do CAF. O modelo CAF aqui apresentado também pode ser utilizado para estudos preliminares de eficácia, ao carregar nanopartículas com drogas ativas. Os animais só serão usados mais tarde para avaliar estudos de biodistribução, farmacocinética e eficácia.
Vários nanodrogas alvo de CAF estão sendo desenvolvidas, como nanocálgenas de ferritina para terapia fotodinâmica no câncer de mama e partículas à base de peptídeos para fornecer doxorubicina nos modelos de câncer de próstata39,40. No entanto, poucos estudos se concentraram no isolamento dos CAFs como plataformas celulares para otimização de nanodrogas.
Este protocolo tem algumas limitações. Primeiro, é um protocolo demorado, exigindo a preparação e compra de vários reagentes e materiais. Em segundo lugar, devido à escassez de CAFs no tumor de mama 4T1, seu rendimento é baixo. Os experimentos de nanopartículas devem ser planejados e realizados assim que o número de células necessário for alcançado, uma vez que os CAFs primários sofrem senescência e não podem ser mantidos na cultura por muito tempo. Em conclusão, esse método de isolamento, cultivo e caracterização dos CAFs pode ser uma ferramenta poderosa para acelerar o desenvolvimento de novas nanomedicinas direcionadas na luta contra o câncer.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pela Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) sob o projeto IG 2017-ID. 20172 – P.I. Corsi Fabio. A SM reconhece o centro de Pesquisa Clínica Pediátrica “Romeu e Enrica Invernizzi” que apoia sua posição. AB agradece airc (projeto ID. 20172) e Universidade de Milão para bolsa de pesquisa. As bolsas de pós-doutorado e doutorado de LS e MS são apoiadas pela Universidade de Milão.
ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at – 20 °C. |
Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |