מאמר זה נועד לספק פרוטוקול לבידוד ותרבות של פיברובלסטים הקשורים לסרטן ראשוני ממודל מורין סינגני של סרטן שד טריפל שלילי ויישומה למחקר פרה-אקליני של חלקיקים חדשניים שנועדו למקד את המיקרו-סביבה של הגידול.
פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) הם שחקני מפתח בהקשר של מיקרו-סביבה של הגידול. למרות ירידה במספר בהשוואה לתאי הגידול, CAFs לווסת את התקדמות הגידול ולספק הגנה מפני חסינות antitumor. אסטרטגיות נגד נגדים מתפתחות שואפות לשפץ את המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות אבלציה של CAFs פרו-גידוליגני או תכנות מחדש של פונקציות CAFs ומצב ההפעלה שלהם. גישה מבטיחה היא פיתוח של סוכני משלוח nanosized מסוגל למקד CAFs, ובכך לאפשר משלוח ספציפי של תרופות ומולקולות פעילות. בהקשר זה, מודל הסלולר של CAFs עשוי לספק כלי שימושי עבור הקרנת במבחנה וחקירה ראשונית של nanoformulations כאלה.
מחקר זה מתאר את הבידוד והתרבות של CAFs ראשוני מן המודל מורין 4T1 סינרגטי של סרטן שד טריפל שלילי. חרוזים מגנטיים שימשו בתהליך הפרדה דו-שלבי כדי לחלץ CAFs מגידולים מנותקים. בקרת אימונופנוטיפינג בוצעה באמצעות ציטומטריית זרימה לאחר כל מעבר כדי לאמת את תשואת התהליך. CAFs מבודדים ניתן להשתמש כדי ללמוד את יכולת הפילוח של nanoformulations שונים שנועדו להתמודד עם microenvironment הגידול. ננו-חלקיקי H-פריטין שכותרתם פלואורסצנטית שימשו כננו-חלקיקים מועמדים כדי להקים את השיטה. חלקיקים, חשופים או מצומדים עם ליגנד מיקוד, נותחו עבור הכריכה שלהם CAFs. התוצאות מצביעות על כך ex vivo מיצוי של CAFs השד עשוי להיות מערכת שימושית כדי לבדוק ולאמת חלקיקים עבור מיקוד ספציפי של CAFs tumorigenic.
במהלך העשורים האחרונים, התברר כי הריגת תאים סרטניים בדרך כלל אינה מספיקה כדי למגר ממאירות, כמו microenvironment הגידול עשוי לגרום להישנות הגידול ולעורר התנגדות טיפולית1,2. לאחר מכן הופיעה פרדיגמה חדשנית: מיקוד סטרומה הגידול כדי לשלול את הגידול של גורמים תומכים ובכך, להגביר את היעילות שלכימותרפיה 3,4,5. בפרט, פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) הם מטרה סטרומה מעניינת בגידולים מוצקים רבים6,7. CAFs הם קבוצה הטרוגנית מאוד של תאים אינטראקציה עם תאים ותאים סרטניים של המערכת החיסונית באמצעות הפרשת גורמי גדילה, ציטוקינים, וכימותרפיה; לבנות ול לשפץ את המטריצה החוץ-תאית; ואפשר היווצרות גרורות8,9,10,11,12. בהתאם לסוג הגידול, CAFs להראות פונקציות פרו-tumorigenic, בעוד תת סוגים אחרים של CAFs נראה שיש פונקציות מדכאות גידול13,14. כדי להבהיר טוב יותר את הדיכוטומיה הזו, חשוב אפיון יסודי של CAFs מגידולים ראשוניים ודרסטטיים.
בהקשר זה, תחום מחקר מתפתח התמקד בפיתוח סוכנים ננו-גדולים שנועדו למקד ו /או להרוס CAFs על ידי אספקת מולקולות ותרופות פעילות מסוגל לשפץ את microenvironment הגידול15,16,17,18. מספר סוגים של חלקיקים תוכננו כדי להשיג אבלציה CAF על ידי תרופות ציטוטוקסיות, כדי לגרום לטיפול פוטודינמי ממוקד CAF, או לתכנת מחדש CAFs על ידי החזרתם למצב של קיפאון או גרימת ביטוי ליגנד הקשורים TNF, אשר גורמת אפופטוזיס של תאים סרטניים שכנים16,19. יתר על כן, הפוטנציאל של חלקיקים רבים למקד באופן פעיל סמנים ביולוגיים ספציפיים מעורר תקווה של בחירת תת קבוצות CAF למקד. למרות הספציפיות המוחלטת שלה עבור CAF עדיין מוטל בספק, חלבון הפעלה פיברובלסט (FAP) הוא אחד היעדים המבטיחים ביותר של סטרומה פרו-tumorigenic והוא מנוצל כדי לנווט משלוח nanodrug, ובכך לסלול את הנתיב להתפתחות של ננו-תרופוטיקה ממוקדת CAF20,21,22.
מאמר זה מתאר את הבידוד של CAFs ראשוני ממודל סינגני של סרטן השד מורין ומדווח על השימוש שלהם בחקר יכולת הפילוח של חלקיקים מהונדס לזהות את סמן CAF, FAP. ננו-שניות של פריטין משמשות כננו-מערכות מועמדות כדי להגדיר את השיטה, שכן הספציפיות שלהם של המסירה עשויה להיות מעוצבת על ידי החשיפה פני השטח של moieties מיקוד23,24. יתר על כן, פריטינים הוכחו בהצלחה להיות מעבורות ביו תואמות מעולה עבור יישומי antitumor, מפעיל הצטברות מהירה של המטען במסת הגידול25,26,27. עד כה, מחקרים פרה-קליניים של מערכות ננו-מיקוד CAF מעורבים בבדיקות במבחנה על קווי תאים פיברובלסט מגורה בתרבות עם שינוי גורם גדילה-בטא כדי לגרום להפעלת התא ואת הביטוי של כמה תכונות אימונופנוטיפיקיות של CAFs28,29. שיטה זו מוחלת בדרך כלל על קווי תאים מונצחים (כגון NIH3T3, LX-2) והיא מהירה ופשוטה למדי, מניבה תאים מופעלים תוך מספר שעות או ימים. מגבלה היא כי למרות גירוי במבחנה גורמת לביטוי של כמה גנים המיוחסים myofibroblasts מופעל, זה לא יכול לגמרי לשחזר את כל התכונות הביולוגיות של CAFs אמיתי, במיוחד ההטרוגניות שלהם ויוו.
אסטרטגיה נוספת כוללת מיצוי CAFs ראשוני מדגימות גידול אנושי או עכבר30,31. זה מבטיח כי הפעלת CAF מתרחשת בהקשר פיזיולוגי, וכי ההטרוגניות של אוכלוסיות CAF נשמרת. על פי מטרת המחקר, CAFs עשוי להיגזר ממקורות שונים, ובכך להציע את האפשרות ללמוד את המצב האמין ביותר. הפרוטוקול שדווח כאן יהיה בעל ערך עבור מדענים המבקשים לבצע הערכה ראשונית של הפונקציונליות של חלקיקים חדשניים שנועדו למקד CAFs ממודל סרטן השד מורין. CAFs מבודד יהיה שימושי עבור הקרנת חלקיקים אלה כי הם מבטיחים מספיק כדי להמשיך להערכת vivo במודלים בעלי חיים של סרטן. זה יהיה רלוונטי בשלבים הראשונים של ייצור ננו-חלקיקים, נהיגה ננוטכנולוגיה לקראת עידון של עיצוב ננו-חלקיקים על ידי התחשבות בעיקר באסטרטגיה של immobilization ליגנד כדי להשיג תכונות מיקוד אופטימליות.
CAFs מתגלים כשחקני מפתח בשיפוץ מטריצה חוץ תאית, קידום התקדמות גרורות והגבלת הגישה לתרופות לאתר הגידול34. עם זאת, בשל ההטרוגניות שלהם, תפקידיהם עדיין שנויים במחלוקת – חלק מה-CAFs הם גידוליים, בעוד שלתת-סוגים אחרים יש תפקיד מדכא גידולים. בהקשר זה, הבידוד שלהם יכול להיות עניין קיצוני לשפוך אור נוסף על תפקידם השנוי במחלוקת בהתקדמות הסרטן, אשר יהיו השלכות קליניות חשובות12,31. יתר על כן, מיצוי CAF מוצלח ממודלים אנושיים ופרה-אקליניים של גידול עכברים יקל גם על פיתוח תרופות חדשות למיקוד CAF. מאמר זה מדווח על שיטה לבודד ביעילות ותרבות CAFs ראשוני ממודל פרה-אקליני של סרטן השד. בהתבסס על ניסיון, שלושה צעדים ניסיוניים משפיעים בעיקר על הצלחת הפרוטוקול.
הראשון עובד מהר כדי למנוע צבירה של השעיות תאים הקשורים לסיכון של קרישה בעמודה והאטה של שפכים תאים: למעשה, כאשר תאים שעברו דרך העמודה היו מקובצים יחד, ההסתברות של תהליך בידוד תת אופטימלי גדל, ואת התרבויות הסופיות הכילו שיבוטים תאים “מזהמים”. השני הוא איגום תאים מגידולים שונים לאחר מעבר הדלדול כדי להבטיח מספיק תאים לעבור בשלב ההעשרה הסופי. הבעיה הקריטית הסופית היא ציפוי התאים שחולצו בצפיפות תאים גבוהה, ככל הנראה החל מבאר אחת של צלחת 24-well כדי להגביר את צמיחת התאים ואת הרחבת המושבה עבור עד 4-5 מעברים. אם התאים נזרעו בצפיפות נמוכה, הם התרחבו על פני השטח החופשיים והפסיקו במהירות לשכפל.
מספר מחקרים כבר תיארו שיטות מיצוי CAF ממוצא אנושי ועכבר, כדי ללמוד את תפקידם בקידום התפתחות סרטן ו פולשניות. זה נעשה בסוגים רבים של גידולים, כולל סרטן השד, מלנומה, cholangiocarcinoma, ואדנוקרצינומההלבלב 35,36,37,38. עם זאת, בשל היעדר סמני CAF ספציפיים ועל ההטרוגניות שלהם, התוצאות של תהליכים אלה עדיין תת אופטימלי.
כאן, התאים המבודדים שימשו לאימות יכולת פילוח CAF של ננו-נצ’ים HFn פונקציונליים עם moieties מיקוד נגד FAP. השימוש בתרבויות ראשוניות של CAFs היה יתרון משמעותי, המאפשר אימות של ex vivo nanostrategy עם ניסוי מחייב הרבה יותר פשוט וחסכוני מאשר לעשות את זה ישירות vivo בשלב ראשוני זה של אופטימיזציה nanodrug.
במובן זה, בדיקות ex vivo על CAFs יכול להקדים בניסויים בבעלי חיים vivo על ידי מתן אפשרות הקרנה ובחירה של חלקיקים מבטיחים ביותר עבור מיקוד אופטימלי של CAF. מודל CAF המוצג כאן עשוי לשמש גם למחקרי יעילות ראשוניים, בעת טעינת חלקיקים עם תרופות פעילות. בעלי חיים ישמשו רק מאוחר יותר להערכת ייחוס ביולוגי, פרמקוקינטיקה, ומחקרי יעילות.
מספר ננו-דראגים ממוקדי CAF מפותחים, כגון ננו-ים של פריטין לטיפול פוטודינמי בסרטן השד וחלקיקים מבוססי פפטיד כדי לספק דוקסורוביצין במודלים של סרטן הערמונית39,40. עם זאת, לא הרבה מחקרים התמקדו בבידוד של CAFs כפלטפורמות תאים עבור אופטימיזציה nanodrug.
לפרוטוקול זה יש כמה מגבלות. ראשית, זהו פרוטוקול גוזל זמן, הדורש הכנה ורכישה של מספר ריאגנטים וחומרים. שנית, בשל המחסור של CAFs בגידול השד 4T1, התשואה שלהם נמוכה. ניסויי ננו-חלקיקים צריכים להיות מתוכננים ומבוצעים ברגע שמספר התא הנדרש מושג, כמו CAFs ראשוני לעבור senescence ולא ניתן לשמור על התרבות במשך זמן רב. לסיכום, שיטה זו של בידוד CAFs, culturing, ואפיון יכול להיות כלי רב עוצמה כדי להאיץ את הפיתוח של nanomedicines ממוקד חדש במאבק נגד סרטן.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי Associazione Italiana per la Ricerca סול Cancro (AIRC) תחת IG 2017-ID. 20172 פרויקט – P.I. קורסי פאביו. SM מכירה במרכז המחקר הקליני לילדים “רומיאו ואנריקה אינברניצי” התומך בעמדתה. AB מודה AIRC (ID. 20172 פרויקט) ואוניברסיטת מילאנו עבור מלגת מחקר. מלגות פוסט-דוקטורט ודו-דוקטורט של LS ותל.אס נתמכות על ידי אוניברסיטת מילאנו.
ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at – 20 °C. |
Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |