本文旨在为三阴性乳腺癌的同步粘膜模型中原发性癌症相关成纤维细胞的分离与培养提供协议,并应用于旨在针对肿瘤微环境的新型纳米粒子的临床前研究。
癌症相关成纤维细胞 (CAF) 是肿瘤微环境中的关键角色。尽管与肿瘤细胞相比数量减少,但CAF可以调节肿瘤进展,并提供抗肿瘤免疫保护。新兴的抗癌策略旨在通过消融亲肿瘤的CAF或重新编程CAF功能及其激活状态来重塑肿瘤微环境。一种很有前途的方法是开发纳米化输送剂,能够瞄准CAF,从而允许药物和活性分子的特定输送。在这方面,CAF的细胞模型可以为 体外 筛选和这种纳米形态的初步研究提供有用的工具。
本研究描述了原发性CAF与三阴性乳腺癌的合成4T1粘膜模型的分离和文化。磁珠用于两步分离过程,从分离的肿瘤中提取CAF。免疫表型控制在每次通过后使用流细胞测量来验证过程产量。可利用分离的CAF来研究用于处理肿瘤微环境的不同纳米成形物的瞄准能力。荧光标记的H-铁蛋白纳米穴被用作候选纳米粒子来建立这种方法。对纳米粒子进行分析,分析其是否与目标配体结合,以增强其与CAF的结合性。结果表明,乳房CAF的 体外 提取可能是测试和验证纳米粒子的一个有用的系统,用于肿瘤性CAF的特定靶向。
在过去的几十年里,很明显,杀死肿瘤细胞通常不足以消除恶性肿瘤,因为肿瘤微环境可能促使肿瘤复发并诱导治疗耐药性1,2。一个新的范式已经出现:瞄准肿瘤频闪剥夺肿瘤的支撑因子,从而,提高化疗的疗效3,4,5。特别是,癌症相关的成纤维细胞(CAFs)是许多固体肿瘤6,7有趣的频闪靶点。CAF是一组非常异质的细胞,通过生长因子、细胞因子和化疗因子的分泌与癌细胞和免疫系统细胞相互作用:建立和改造细胞外矩阵;并启用转移形成8,9,10,11,12。根据肿瘤类型,CAF显示亲肿瘤功能,而其他亚型的CAF似乎有肿瘤抑制功能13,14。为了更好地澄清这种二分法,从原发性肿瘤和转移性肿瘤中彻底描述CAF是很重要的。
在这方面,一个新兴的研究领域侧重于纳米化剂的开发,旨在通过提供活性分子和药物来瞄准和/或摧毁CAF,从而能够重塑肿瘤微环境15、16、17、18。几种类型的纳米粒子被设计成通过细胞毒性药物实现CAF消融,诱导CAF靶向光动力治疗,或通过将CAF恢复到静止状态或诱导TNF相关凋亡诱导配体表达,从而诱导邻近癌细胞16、19的凋亡。此外,许多纳米粒子积极瞄准特定生物标记的潜力,使人们希望选择CAF子集作为目标。虽然它对CAF的绝对特异性仍然受到质疑,但成纤维细胞活化蛋白(FAP)是亲肿瘤频闪最有前途的目标之一,并被利用来引导纳米药物的输送,从而为CAF靶向纳米疗法20、21、22的发展铺平了道路。
本文描述了原发性CAF与乳腺癌的合成模型的分离,并报告了它们在研究纳米粒子的靶向能力时所用,该粒子旨在识别CAF标记,FAP。铁蛋白纳米穴被用作候选纳米系统来建立这种方法,因为其交付特异性可能由目标moieties23,24的表面暴露所塑造。此外,铁蛋白已被成功证明是抗肿瘤应用的优秀生物相容穿梭体,触发肿瘤质量25、26、27的有效载荷的快速积累。迄今为止,CAF靶向纳米系统临床前研究已经涉及对培养中刺激的成纤维细胞系进行体外测试,通过转化生长因子β来诱导细胞活化和CAFs28、29的一些免疫表型特征的表达。这种方法通常应用于不朽的细胞系(如NIH3T3,LX-2),并且非常快速和简单,在几个小时或几天内产生激活的细胞。一个限制是,虽然体外刺激诱导一些基因的表达归因于激活肌纤维细胞,它不能完全回顾所有生物特征的真正的CAF,特别是其异质性在体内。
另一项策略是从人类或小鼠肿瘤样本中提取原发性CAF,30,31。这确保了 CAF 激活发生在生理环境中,并且保持 CAF 子群的异质性。根据研究目标,CAF可能来自不同的来源,从而提供了研究最可靠的条件的可能性。这里报道的协议对于寻求对新型纳米粒子的功能进行初步评估的科学家来说很有价值,这些纳米粒子旨在从乳腺癌模型中瞄准CAF。分离的CAF对于筛选那些有希望进行癌症动物模型体内评估的纳米粒子是有用的。这将在纳米粒子生产的第一步中具有相关性,通过主要考虑配体固定策略,以实现最佳目标特性,推动纳米技术专家向纳米粒子设计的精细化迈进。
CAF正在成为重塑细胞外基质、促进转移进展和限制药物进入肿瘤位点34的关键角色。然而,由于它们的异质性,它们的作用仍然是有争议的,一些CAF是肿瘤原性的,而其他一些亚型似乎具有肿瘤抑制作用。在这种情况下,他们的隔离可以是极为感兴趣的,以揭示他们备受争议的作用,在癌症的进展,这将具有重要的临床影响12,31。此外,从人类和临床前小鼠肿瘤模型中成功提取CAF也将促进新的CAF靶向药物的开发。本文报告了一种有效分离和培养原发性CAF与乳腺癌的同步临床前模型的方法。根据经验,三个实验步骤主要影响协议的成功。
第一种是快速工作,以避免与列中凝固和减缓细胞排泄的风险相关的细胞悬浮聚合:事实上,当通过列的细胞聚集在一起时,亚最佳隔离过程的概率增加,最终培养物包含”污染物”细胞克隆。第二种是消耗通过后从不同肿瘤中汇集细胞,以保证在最后的浓缩步骤中通过足够的细胞。最后一个关键问题是将提取的细胞电镀在高细胞密度下,很可能从24井板的一口井开始,以促进细胞生长和菌落扩张长达4+5段。如果细胞以低密度播种,它们就会在自由表面扩张并迅速停止复制。
一些研究已经描述了人类和小鼠起源的CAF提取方法,以研究它们在促进癌症发展和侵入性方面的作用。这在许多类型的肿瘤中都做过,包括乳腺癌、黑色素瘤、胆囊癌和胰腺癌35、36、37、38。然而,由于缺乏特定的CAF标记及其异质性,这些过程的结果仍然不尽如人意。
在这里,分离的细胞被用来验证HFn纳米穴的CAF靶向能力,该纳米穴具有抗FAP靶向护身盆功能。CAFs 初级培养物的使用是一个显著优势,它使纳米策略 前体内 的验证具有比在纳米药物优化的这个初步阶段直接 在体内 进行简单且具有成本效益的结合实验。
从这个意义上说,CAF的前 体内 测试可以在 活体 动物实验中先行,允许筛选和选择最有前途的纳米粒子,以最佳定位CAF。此处介绍的 CAF 模型也可用于初步疗效研究,当将纳米粒子加载到活性药物时。动物以后将只用于评估生物分布、药理动力学和疗效研究。
几个CAF靶向纳米药物正在开发中,如用于乳腺癌光动力治疗的铁氧体纳米卡和基于肽的颗粒,以在前列腺癌模型39,40中提供多索鲁比辛。然而,没有多少研究集中在隔离CAF作为细胞平台的纳米药物优化。
此协议有一些限制。首先,这是一个耗时的程序,需要准备和购买几个试剂和材料。其次,由于4T1乳腺肿瘤中CAF的稀缺性,其产量较低。纳米粒子实验应在达到所需细胞数后立即进行,因为初级CAF会衰老,不能在培养中长期维持。总之,这种CAF分离、培养和定性的方法可以成为加速开发新的靶向纳米药物对抗癌症的有力工具。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了意大利协会的支持, 根据 Ig 2017 – id. 20172 项目 – P. i. 科西 · 法比奥。SM承认儿科临床研究中心”罗密欧和恩里卡因弗尼齐”,支持她的立场。AB感谢AIRC(ID.20172项目)和米兰大学的研究奖学金。LS 和 MS 博士后和博士奖学金由米兰大学提供支持。
ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at – 20 °C. |
Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |