本論文は、三重陰性乳癌の同種マウスモデルからの原発性癌関連線維芽細胞の単離と培養と、腫瘍微小環境を標的とするように設計された新規ナノ粒子の前臨床試験への応用を目的とする。
癌関連線維芽細胞(CAF)は、腫瘍微小環境の文脈における主要なアクターである。腫瘍細胞と比較して数が減少しているにもかかわらず、CAFは腫瘍の進行を調節し、抗腫瘍免疫からの保護を提供する。新たな抗がん戦略は、腫瘍性腫瘍性CAFの切り替えまたはCAF機能の再プログラミングとその活性化状態を通じて腫瘍微小環境を再構築することを目指しています。有望なアプローチは、CAFを標的とすることができるナノサイズの送達剤の開発であり、したがって、薬物および活性分子の特異的な送達を可能にする。この文脈において、CAFの細胞モデルは、そのようなナノ製剤の インビトロ スクリーニングおよび予備調査のための有用なツールを提供し得る。
本研究では、三重陰性乳癌の同種4T1マウスモデルからの原発性CAFの分離と培養について説明する。磁気ビーズは、解離された腫瘍からCADFを抽出するために2段階の分離プロセスで使用された。免疫フェノタイピング制御は、プロセス歩留まりを検証するために各通過後のフローサイトメトリーを用いて行った。分離されたCAFは、腫瘍微小環境に取り組むために設計された異なるナノ製剤の標的化能力を研究するために使用することができる。蛍光標識されたHフェリチンナノケージは、この方法を設定する候補ナノ粒子として使用した。ナノ粒子は、裸または標的リガンドと共役し、CAFへの結合について分析した。この結果は、乳房CAFの ex vivo 抽出が、腫瘍化CAFの特異的標的化についてナノ粒子をテストおよび検証するのに有用なシステムである可能性を示唆している。
過去数十年の間に、腫瘍の微小環境が腫瘍の再発を促し、治療抵抗1,2を誘導する可能性があるため、腫瘍細胞の死滅は悪性腫瘍を根絶するのに十分でないことが明らかになりました。新しいパラダイムが出現しました: 腫瘍の間質を標的にして腫瘍を支持因子から奪い、化学療法の有効性を高める3,4,5.特に、癌関連線維芽細胞(CAF)は、多くの固形腫瘍6,7において興味深い間質標的である。WFは、増殖因子、サイトカイン、ケモカインの分泌を通じて免疫系の癌細胞および細胞と相互作用する細胞の非常に不均一なグループである。細胞外マトリックスを構築し、改造する;転移形成8、9、10、11、12を有効にします。腫瘍の種類に応じて、CAFは腫瘍形成機能を示し、他のサブタイプのCAFは腫瘍抑制機能13,14を有するようだ。この二分法をより明確にするためには、原発性腫瘍および転移性腫瘍からのCAFの完全な特徴付けが重要である。
この文脈において、新たな研究分野は、腫瘍微小環境15、16、17、18を改造することができる活性分子および薬物を送達することによって、CAFを標的および/または破壊するように設計されたナノサイズの薬剤の開発に焦点を当てている。ナノ粒子のいくつかのタイプは、細胞傷害性薬物によるCAFアブレーションを達成し、CAF標的光線力学療法を誘導するか、または静止状態に戻すことによってCAFを再プログラムするか、または隣接する癌細胞16、19のアポトーシスを誘導するTNF関連アポトーシス誘導リガンド発現を誘導するように設計されている。さらに、多くのナノ粒子が特定の生物学的マーカーを積極的に標的とする可能性は、標的とするCAFサブセットを選択する望みを生み出す。CAFに対する絶対的特異性は依然として問われ、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)は、腫瘍性基質の最も有望な標的の1つであり、ナノドラッグの送達を操縦するために利用され、したがって、CAF標的性ナノセラピューティクス20、21、22の開発への道を開く。
本論文では、マウス乳癌の同系モデルからの原発性CAFの分離について述べ、CAFマーカーFAPを認識するように設計されたナノ粒子の標的化能力の研究におけるそれらの使用を報告する。フェリチンナノケージは、その方法を設定する候補ナノシステムとして使用され、その送達の特異性は、ターゲティング部分23、24の表面露光によって形成され得る。さらに、フェリチンは、抗腫瘍剤用途に対して優れた生体適合性シャトルであることが実証されており、腫瘍質量25、26、27にペイロードの急速な蓄積を引き起こす。現在までに、CAF標的ナノシステムの前臨床試験は、細胞活性化およびCAF2の免疫表現機能の発現を誘導する増殖因子βを培養して刺激された線維芽細胞株のvitro試験に関与している。この方法は、通常、不死化細胞株(NIH3T3、LX-2など)に適用され、非常に迅速かつ単純であり、数時間または数日で活性化細胞を得る。制限は、インビトロ刺激は活性化された筋線維芽細胞に起因するいくつかの遺伝子の発現を誘導するが、実際のCAFのすべての生物学的特徴、特に生体内でのそれらの不均一性を完全に再現することはできない。
もう一つの戦略は、ヒトまたはマウス腫瘍サンプル30,31からの原発CAFの抽出を含む。これにより、CAF活性化が生理学的な文脈で起こり、CAF亜集団の不均一性が維持されることを保証する。研究目的によれば、CAFは異なるソースから導出され、最も信頼性の高い状態を研究する可能性を提供する。ここで報告されたプロトコルは、マウス乳癌モデルからCAFを標的にするように設計された新しいナノ粒子の機能性の予備的評価を行おうとする科学者にとって貴重であろう。分離されたCAFは、癌の動物モデルにおける生体内評価を進めるのに十分有望なナノ粒子をスクリーニングするのに有用であろう。これは、ナノ粒子生産の最初のステップで関連し、ナノ技術者は主に最適な標的化特性を達成するためのリガンド固定化の戦略を検討することによって、ナノ粒子設計の洗練に向けて推進する。
CAFは、細胞外マトリックスのリモデリング、転移進行の促進、および腫瘍部位34への薬物アクセスの制限における主要なプレーヤーとして浮上している。しかし、その異質性のために、その役割は依然として議論の余地があり、一部のCAFは腫瘍性であるのに対し、他のサブタイプは腫瘍抑制的な役割を持っているようだ。この文脈では、彼らの孤立は、重要な臨床的意味を持つ癌進行における彼らの多くの議論の役割にもっと光を当てることに極度の関心を持つことができます。さらに、ヒトおよび前臨床マウス腫瘍モデルからのCAF抽出が成功すれば、新しいCAF標的薬の開発も容易になるだろう。本論文は、乳がんの同系前臨床モデルから原発CAFを効率的に分離し培養する方法を報告する。経験に基づいて、3つの実験的なステップは、主にプロトコルの成功に影響を与えます。
1つ目は、カラム内で凝固し、細胞流出を遅らせるリスクに関連する細胞懸濁液の凝集を避けるために速く働いている:実際、カラムを通過した細胞が一緒に集まったとき、最適な分離プロセスの確率が増加し、最終的な培養物には「汚染物質」細胞クローンが含まれていた。2つ目は、最終的な濃縮ステップで十分な細胞を通過させるために、枯渇通過後に異なる腫瘍から細胞をプールすることです。最終的な重要な問題は、抽出された細胞を高い細胞密度でめっきすることですが、おそらく24ウェルプレートの単一のウェルから始まり、細胞の成長とコロニーの拡張を最大4〜5回の通路にまで高めます。細胞が低密度で播種された場合、彼らは自由表面に膨張し、すぐに複製を停止しました。
いくつかの研究は、すでにヒトとマウスの両方の由来のCAF抽出方法を説明しています, 癌の発達と侵襲性を促進する上でのそれらの役割を研究します..これは、乳癌、黒色腫、胆管癌、および膵腺癌35、36、37、38を含む多くのタイプの腫瘍において行われてきた。しかし、特定のCAFマーカーの欠如とその不均一性のために、これらのプロセスの結果は依然として最適ではありません。
ここで、単離された細胞を用いて、抗FAP標的部分で機能化したHFnナノケージのCAF標的化能力を検証した。CADfの一次培養物の使用は、ナノ医薬品最適化のこの予備段階で直接in vivoで行うよりもはるかに簡単で費用対効果の高い結合実験でナノストラテジー ex vivoの検証を可能にする、重要な利点でした。
この意味で、CAFの ex vivo 試験は、CAFの最適な標的化のための最も有望なナノ粒子のスクリーニングおよび選択を可能にすることによって 、生体内 動物実験に先行することができる。ここで提示されるCAFモデルは、活性薬物を用いたナノ粒子をロードする際の予備的有効性研究にも使用することができる。動物は、バイオディストリビューション、薬物動態、および有効性の研究を評価するために後で使用されます。
乳癌における光力学療法のためのフェリチンナノケージや、前立腺癌モデル39,40でドキソルビシンを送達するペプチド系粒子など、いくつかのCAFターゲティングナノ医薬品が開発されている。しかし、ナノドラッグ最適化のための細胞プラットフォームとしてのCAFの分離に焦点を当てた研究はあまりありません。
このプロトコルには、いくつかの制限があります。第一に、それはいくつかの試薬および材料の準備および購入を要求する時間のかかる議定書である。第二に、4T1乳房腫瘍におけるCAFの不足のために、その収率は低い。一次CAFは老化を受け、培養中に長期間維持できないため、必要な細胞数が達成されるとすぐにナノ粒子実験を計画し、実行する必要があります。結論として、このCAの分離、培養、および特徴付けの方法は、がんとの闘いにおける新しい標的ナノ医薬品の開発を加速するための強力なツールとなり得る。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、IG 2017-ID. 20172 プロジェクト – P.I. コルシ ファビオの下でラ・リセルカ・スル・カンクロあたりアソシアツィオーネイタリアーナによってサポートされました。SMは、彼女の地位を支える小児臨床研究センター「ロミオとエンリカ・インヴェルニッツィ」を認めています。ABは、研究フェローシップのためのAIRC(ID. 20172プロジェクト)とミラノ大学に感謝します。LSとMSのポスドクと博士のフェローシップは、ミラノ大学によってサポートされています。
ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at – 20 °C. |
Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |