Summary

Инструменты для оценки в режиме реального времени модели инфекции Pseudomonas aeruginosa

Published: April 06, 2021
doi:

Summary

Синтетическая среда мокроты при муковисцидозе (SCFM2) может быть использована в сочетании как с конфокальной лазерной сканирующей микроскопией, так и с флуоресцентно-активированной сортировкой клеток для наблюдения бактериальных агрегатов с высоким разрешением. В этой статье подробно описываются методы оценки совокупных популяций во время антимикробного лечения в качестве платформы для будущих исследований.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (Pa) является одним из наиболее распространенных условно-патогенных микроорганизмов, связанных с муковисцидозом (МВ). Как только колонизация Па установлена, большая часть инфекционных бактерий образует биопленки в мокроте дыхательных путей. Было показано, что биопленки Па, выделенные из мокроты муковисцидного средства, растут в небольших, плотных агрегатах ~ 10-1000 клеток, которые пространственно организованы и демонстрируют клинически значимые фенотипы, такие как устойчивость к противомикробным препаратам. Одной из самых больших проблем при изучении того, как агрегаты Pa реагируют на изменение среды мокроты, является отсутствие питательных и надежных систем, которые способствуют образованию агрегатов. Используя синтетическую среду мокроты CF (SCFM2), историю жизни агрегатов Pa можно наблюдать с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) и анализа изображений с разрешением одной клетки. Эта система in vitro позволяет наблюдать тысячи агрегатов различного размера в режиме реального времени, трех измерениях и в микроном масштабе. На индивидуальном и популяционном уровнях способность группировать агрегаты по фенотипу и положению облегчает наблюдение агрегированных агрегатов на разных стадиях развития и их реакцию на изменения в микросреде, такие как лечение антибиотиками, которые должны быть дифференцированы с точностью.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (Pa) является оппортунистическим патогеном, который устанавливает хронические инфекции у людей с ослабленным иммунитетом. Для людей с генетическим заболеванием муковисцидоз (МВ) эти инфекции могут охватывать всю жизнь. Муковисцидоз вызывает накопление вязкой, богатой питательными веществами мокроты в дыхательных путях, которая со временем колонизируется различными микробными патогенами. Па является одним из наиболее распространенных патогенов муковисцидоза, колонизируя дыхательные пути в раннем детстве и устанавливая трудноизуемые инфекции1. Па остается значительной клинической проблемой и считается ведущей причиной смертности у лиц с муковисцидозом, несмотря на улучшение схем терапии в последниегоды2,3. Этот фенотип персистенции и повышение толерантности к антибиотикам принесли Па место в группе патогенов, идентифицированных как Центрами по контролю и профилактике заболеваний (CDC), так и Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве исследовательских приоритетов для разработки новых терапевтических стратегий – патогенов ESKAPE4.

Как и другие патогены ESKAPE, приобретенная устойчивость к антибиотикам распространена в Pa,но есть также много внутренних свойств, которые способствуют антимикробной толерантности Pa. Среди них способность Па образовывать агрегаты — высокоплотные кластеры из ~10-1000 клеток, которые могут наблюдаться при множественных инфекциях, в том числе при МВ мокроте больного5,6. Подобно Pa, изученным в других системах биопленки, агрегаты Pa демонстрируют клинически значимые фенотипы, такие как повышенная устойчивость к антибиотикам и активация клеточно-клеточной коммуникации (кворум-зондирование (QS)). Например, было показано, что агрегаты Па используют QS-регулируемое поведение для борьбы с другими микробами, а также переносят антимикробные методы лечения, такие как производство пиоцианина7. Способность изучать такое поведение дает захватывающее представление о бактериальных экосистемах в среде, подобной той, в которой они существуют в организме человека.

Одной из самых больших проблем при изучении того, как агрегаты Pa реагируют на изменение среды мокроты, является отсутствие питательных и надежных систем, которые способствуют образованию агрегатов. Многое из того, что известно о Па, было обнаружено с использованием систем in vitro, в которых клетки растут планктонально или в характерной поверхностно-прикрепленной, «грибной» архитектуре, которая не наблюдалась in vivo8. В то время как классические модели роста биопленки, такие как прототочные клетки или твердый агар, дали обширные и ценные знания о поведении бактерий и механизмах толерантности к антибиотикам, эти результаты не всегда переводятся in vivo. Многие модели in vitro имеют ограниченную способность имитировать среду роста места инфекции человека, что требует дорогостоящих исследований in vivo. В свою очередь, многим моделям in vivo не хватает гибкости и разрешения, предоставляемых методами in vitro.

Синтетический муковисцидоз мокроты (SCFM2) предназначен для обеспечения среды для роста Па, аналогичной той, которая наблюдается во время хронической инфекции в легких муковисцидоза. SCFM2 включает источники питания, идентифицированные в отхаркиваемой смуте CF в дополнение к муцину, липидам и ДНК. Рост Pa в SCFM2 требует почти идентичного набора генов, необходимых для роста фактической мокроты, и поддерживает естественное образование агрегата Pa 9,10. После инокуляции планктонные клетки образуют агрегаты, которые увеличиваются в размерах за счет расширения. Отдельные клетки (называемые мигрантами) высвобождаются из агрегатов, мигрируют в неколонизированные районы и образуют новые агрегаты10. Эту историю жизни можно наблюдать с помощью CLSM и анализа изображений с разрешением одной клетки. Агрегаты Па, образующиеся в SCFM2, имеют размеры, аналогичные тем, которые наблюдаются в легкомCF 10. Эта модель позволяет наблюдать несколько агрегатов различного размера в режиме реального времени и в трех измерениях в микроновом масштабе. Покадровая микроскопия позволяет отслеживать тысячи (~50 000) агрегатов в одном эксперименте. Использование программного обеспечения для анализа изображений позволяет количественно оценить совокупные фенотипы по микроснимкам, включая совокупный объем, площадь поверхности и положение в трех измерениях до ближайших 0,1 мкм, как на индивидуальном агрегированном, так и на популяционном уровнях. Наличие способности группировать агрегаты по фенотипу и положению позволяет с точностью дифференцировать агрегаты на разных стадиях развития, а также их реакцию на изменениемикросреды 6,11.

Применение SCFM2 для изучения агрегатов Pa в анализах с низким объемом и высокой пропускной способностью делает его гибкой и экономически эффективной моделью. В качестве определенной среды SCFM2 обеспечивает однородность и воспроизводимость на нескольких платформах, обеспечивая питательную и физически релевантную методику изучения агрегатов Pa in vitro9. Приложения включают его использование в сочетании с CLSM для наблюдения пространственной организации и толерантности к антибиотикам при высоком разрешении (как описано в этой статье о методах). Возможность проводить эксперименты, которые предоставляют данные в микроновом масштабе в режиме реального времени, позволяет изучать внутривидовые и межвидовые взаимодействия, поскольку они могут происходить in vivo. Например, SCFM2 ранее использовался для изучения пространственной динамики клеточно-клеточной коммуникации в совокупных популяциях через сеть систем, используемых Pa для регулирования нескольких генов, которые способствуют вирулентности и патогенезу6.

Figure 1
Рисунок 1:Графическое изображение основных экспериментальных этапов. (A)SCFM2 инокулируют Па-клетками и позволяют формировать агрегаты в чашке со стеклянным дном. (B) Агрегаты переносятся в конфокальный микроскоп и добавляют антибиотик. Изображены три технические реплики (камеры 1-3) и контрольная скважина (4) инокулированного SCFM2 без лечения антибиотиками. Агрегаты визуализируются с использованием CLSM в течение 18 ч. (C) После первоначальной 18-ч визуализации агрегаты обрабатывают йодидом пропидия для визуализации мертвых клеток и визуализируют с помощью CLSM (D) Агрегаты с желаемым фенотипом отделяют от SCFM2 с помощью FACS. Сокращения: SCFM2 = синтетический муковисцидоз мокроты; Pa = Синегнойная палочка; CLSM = конфокальная лазерная сканирующая микроскопия; FACS = флуоресцентная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Здесь демонстрируется полезность SCFM2 для изучения влияния лечения антибиотиками на агрегаты Pa в режиме реального времени, за которым следует использование клеточного подхода для выделения популяций агрегатов с различными фенотипами для последующего анализа(рисунок 1).

Protocol

1. Подготовьте синтетическую среду муковисцидоза (SCFM2) ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка SCFM2 состоит из трех основных этапов, описанных ниже(рисунок 2). Для получения полной информации и ссылок см.9,10,12. <p class="jove_content" fo:…

Representative Results

В этой работе подробно описываются методы наблюдения агрегатов Па в высоком разрешении и в среде, аналогичной хронической инфекциилегкого МВ 9,10,12. SCFM2 обеспечивает систему in vitro, которая способствует естественной агрегации <em…

Discussion

Эта работа представила методологии, которые могут быть объединены для изучения бактериальных совокупных популяций при наличии и отсутствии лечения антибиотиками. CLSM с высоким разрешением позволяет визуализировать изменения в совокупной биомассе и структурной ориентации агрегатов ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.E.D поддерживается стартовыми фондами, предоставляемыми Департаментом молекулярной медицины Университета Южной Флориды, а также исследовательским грантом CFF (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 – 02 (PI, Chen)) и Институтом микробиомов USF. Мы благодарим лабораторию Уайтли за постоянное сотрудничество с наборами данных, связанных с этой рукописью. Мы благодарим д-ра Чарльза Секереса за содействие в сортировке FACS. Рисунки были созданы A.D.G и S.E.D с использованием Biorender.com.

Materials

Amino acids
Alanine AcrEquation 1s Organics 56-41-7
Arginine HCl MP 1119-34-2
Asparagine AcrEquation 1s Organics 56-84-8 Prepared in 0.5 M NaOH
Cystine HCl Alfa Aesar L06328
Glutamic acid HCl AcrEquation 1s Organics 138-15-8
Glycine AcrEquation 1s Organics 56-40-6
Histidine HCl H2O Alfa Aesar A17627
Isoleucine AcrEquation 1s Organics 73-32-5
Leucine Alfa Aesar A12311
Lysine HCl Alfa Aesar J62099
Methionine AcrEquation 1s Organics 63-68-3
Ornithine HCl Alfa Aesar A12111
Phenylalanine AcrEquation 1s Organics 63-91-2
Proline Alfa Aesar A10199
Serine Alfa Aesar A11179
Threonine AcrEquation 1s Organics 72-19-5
Tryptophan AcrEquation 1s Organics 73-22-3 Prepared in 0.2 M NaOH
Tyrosine Alfa Aesar A11141 Prepared in 1.0 M NaOH
Valine AcrEquation 1s Organics 72-18-4
Antibiotic
Carbenicillin Alfa Aesar J6194903
Day-of Stocks
CaCl2 * 2H2O Fisher Chemical C79-500
Dextrose (D-glucose) Fisher Chemical 50-99-7
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Fisher (Avanti Polar Lipids) 4235-95-4 shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform
FeSO4 * 7H2O AcrEquation 1s Organics 7782-63-0 this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh
L-lactic acid Alfa Aesar L13242 pH stock to 7 with NaOH
MgCl2 * 6H2O AcrEquation 1s Organics 7791-18-6
N-acetylglucosamine  TCI A0092
Prepared solids
Porcine mucin Sigma M1778-100G UV-sterilize
Salmon sperm DNA Invitrogen 15632-011
Stain
Propidium iodide Alfa Aesar J66764MC
Salts
K2SO4 Alfa Aesar A13975
KCl Alfa Aesar J64189 add solid directly to buffered base
KNO3 AcrEquation 1s Organics 7757-79-1
MOPS Alfa Aesar A12914 add solid directly to buffered base
NaCl Fisher Chemical S271-500 add solid directly to buffered base
Na2HPO4 RPI S23100-500.0
NaH2PO4 RPI S23120-500.0
NH4Cl AcrEquation 1s Organics 12125-02-9 add solid directly to buffered base
Consumables
Conical tubes (15 mL) Olympus plastics 28-101
Conical tubes (50 mL) Olympus plastics 28-106
Culture tubes w/air flow cap Olympus plastics 21-129
35 mm four chamber glass-bottom dish CellVis NC0600518
Luria Bertani (LB) broth Genessee Scientific 11-118
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Bioreagents BP2944100
Pipet tips (p200) Olympus plastics 23-150RL
Pipet tips (p1000) Olympus plastics 23-165RL
Serological pipets (5 mL) Olympus plastics 12-102
Serological pipets (25 mL) Olympus plastics 12-106
Serological pipets (50 mL) Olympus plastics 12-107
Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water Genessee Scientific 18-194 Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1
Syringes (10  mL) BD 794412
Syringes (50 mL) BD 309653
0.22 mm PES syringe filter Olympus plastics 25-244
PS cuvette semi-mico Olympus plastics 91-408
Software
Biorender To prepare the figures
FacsDiva6.1.3 Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris Bitplane version 9.6
Zen Black
Equipment
FacsAriallu Becton Dickinson, San Jose, CA
LSM 880 confocal laser scanning microscope Zeiss

References

  1. Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
  2. Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
  3. Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
  4. O’Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
  5. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  6. Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
  7. Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
  8. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
  9. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  10. Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
  11. Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
  12. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  13. Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
  14. Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
  15. Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model. J. Vis. Exp. (170), e62420, doi:10.3791/62420 (2021).

View Video