Summary

Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa

Published: April 06, 2021
doi:

Summary

Il mezzo espettorato della fibrosi cistica sintetica (SCFM2) può essere utilizzato in combinazione sia con la microscopia a scansione laser confocale che con lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per osservare aggregati batterici ad alta risoluzione. Questo documento descrive in dettaglio i metodi per valutare le popolazioni aggregate durante il trattamento antimicrobico come piattaforma per studi futuri.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (Pa) è uno dei più comuni patogeni opportunistici associati alla fibrosi cistica (FC). Una volta stabilita la colonizzazione della Pa, gran parte dei batteri infettivi forma biofilm all’interno dell’espettorato delle vie aeree. I biofilm di Pa isolati dall’espettorato CF hanno dimostrato di crescere in piccoli aggregati densi di ~ 10-1.000 cellule che sono organizzate spazialmente e mostrano fenotipi clinicamente rilevanti come la tolleranza antimicrobica. Una delle maggiori sfide per studiare come gli aggregati di Pa rispondono al mutevole ambiente dell’espettorato è la mancanza di sistemi nutrizionalmente rilevanti e robusti che promuovano la formazione di aggregati. Utilizzando un mezzo sintetico per l’espettorato CF (SCFM2), la storia di vita degli aggregati di Pa può essere osservata utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e l’analisi delle immagini alla risoluzione di una singola cellula. Questo sistema in vitro permette l’osservazione di migliaia di aggregati di varie dimensioni in tempo reale, tridimensionali, e su scala micron. A livello individuale e di popolazione, avere la capacità di raggruppare gli aggregati per fenotipo e posizione facilita l’osservazione degli aggregati in diversi stadi di sviluppo e la loro risposta ai cambiamenti nel microambiente, come il trattamento antibiotico, da differenziare con precisione.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (Pa) è un patogeno opportunistico che stabilisce infezioni croniche in individui immuno-compromessi. Per quelli con la malattia genetica fibrosi cistica (FC), queste infezioni possono durare nel corso della vita. La FC provoca l’accumulo di un espettorato viscoso e ricco di sostanze nutritive nelle vie aeree, che viene colonizzato da una varietà di agenti patogeni microbici nel tempo. Pa è uno dei patogeni CF più diffusi, colonizzando le vie aeree nella prima infanzia e stabilendo infezioni difficili da trattare1. La Pa rimane un problema clinico significativo ed è considerata una delle principali cause di mortalità in quelli con FC, nonostante i regimi terapeutici migliorati negli ultimi anni2,3. Questo fenotipo di persistenza e la crescente tolleranza agli antibiotici hanno fatto guadagnare a Pa un posto in un gruppo di patogeni identificati sia dai Centers for Disease Control (CDC) che dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) come priorità di ricerca per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche: i patogeni ESKAPE4.

Come altri patogeni ESKAPE, la resistenza agli antibiotici acquisita è comune in Pa, ma ci sono anche molte proprietà intrinseche che contribuiscono alla tolleranza antimicrobica Pa. Tra questi c’è la capacità di Pa di formare aggregati-cluster altamente densi di ~ 10-1.000 cellule, che possono essere osservati in infezioni multiple, tra cui l’espettorato del paziente CF5,6. Simile alla Pa studiata in altri sistemi di biofilm, gli aggregati di Pa mostrano fenotipi clinicamente rilevanti come l’aumento della resistenza agli antibiotici e l’attivazione della comunicazione cellula-cellula (quorum sensing (QS)). Ad esempio, gli aggregati di Pa hanno dimostrato di utilizzare comportamenti regolati da QS per combattere altri microbi e tollerare trattamenti antimicrobici come la produzione di piocianina7. La capacità di studiare tali comportamenti offre una visione emozionante degli ecosistemi batterici in un ambiente simile a quello in cui esistono nel corpo umano.

Una delle maggiori sfide per studiare come gli aggregati di Pa rispondono al mutevole ambiente dell’espettorato è la mancanza di sistemi nutrizionalmente rilevanti e robusti che promuovano la formazione di aggregati. Gran parte di ciò che si sa sulla Pa è stato scoperto utilizzando sistemi in vitro in cui le cellule crescono planctonicamente o in una caratteristica architettura “a fungo” attaccata alla superficie che non è stata osservata in vivo8. Mentre i modelli classici di crescita del biofilm, come le cellule di flusso o l’agar solido, hanno prodotto una conoscenza ampia e preziosa sui comportamenti batterici e sui meccanismi di tolleranza agli antibiotici, questi risultati non sempre si traducono in vivo. Molti modelli in vitro hanno una capacità limitata di imitare l’ambiente di crescita del sito di infezione umana, rendendo necessari costosi studi in vivo. A loro volta, molti modelli in vivo mancano della flessibilità e della risoluzione offerte dalle tecniche in vitro.

L’espettorato sintetico della fibrosi cistica (SCFM2) è progettato per fornire un ambiente per la crescita di Pa simile a quello sperimentato durante l’infezione cronica nel polmone CF. SCFM2 include fonti nutrizionali identificate nella CF sputa espettorata oltre a mucina, lipidi e DNA. La crescita di Pa in SCFM2 richiede un set genetico quasi identico a quello richiesto per la crescita nell’espettorato reale e supporta la formazione naturale di aggregati di Pa 9,10. Dopo l’inoculazione, le cellule planctoniche formano aggregati che aumentano di dimensioni attraverso l’espansione. Le singole cellule (denominate migranti) vengono rilasciate dagli aggregati, migrano verso aree non colonizzate e formano nuovi aggregati10. Questa storia di vita può essere osservata utilizzando CLSM e l’analisi delle immagini alla risoluzione di una singola cellula. Gli aggregati di Pa formati in SCFM2 sono di dimensioni simili a quelli osservati nel polmone CF10. Questo modello consente l’osservazione di aggregati multipli di varie dimensioni in tempo reale e in tre dimensioni su scala micron. La microscopia time-lapse consente il tracciamento di migliaia (~ 50.000) di aggregati in un unico esperimento. L’uso di software di analisi delle immagini consente la quantificazione di fenotipi aggregati da micrografie, tra cui volume aggregato, superficie e posizione in tre dimensioni fino all’aeroporto di 0,1 μm, sia a livello di aggregato individuale che di popolazione. Avere la capacità di raggruppare gli aggregati per fenotipo e posizione consente la differenziazione degli aggregati in diversi stadi di sviluppo con precisione, nonché la loro risposta a un microambiente mutevole6,11.

L’applicazione di SCFM2 per studiare aggregati di Pa in saggi a basso volume e ad alto rendimento lo rendono un modello flessibile ed economico. Come mezzo definito, SCFM2 offre uniformità e riproducibilità su più piattaforme, fornendo un metodo nutrizionalmente e fisicamente rilevante per studiare gli aggregati di Pa in vitro9. Le applicazioni includono il suo uso in combinazione con CLSM per osservare l’organizzazione spaziale e la tolleranza agli antibiotici ad alta risoluzione (come descritto in questo documento sui metodi). La capacità di eseguire esperimenti che forniscono dati in tempo reale su scala micron consente lo studio delle interazioni intra-specie e inter-specie come possono verificarsi in vivo. Ad esempio, SCFM2 è stato precedentemente utilizzato per studiare le dinamiche spaziali della comunicazione cellula-cellula in popolazioni aggregate attraverso una rete di sistemi utilizzati da Pa per regolare più geni che contribuiscono alla virulenza e alla patogenesi6.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione grafica delle principali fasi sperimentali. (A) SCFM2 viene inoculato con cellule Pa e lasciato formare aggregati in un piatto di coltura con fondo di vetro. (B) Gli aggregati vengono trasferiti al microscopio confocale e viene aggiunto l’antibiotico. Sono raffigurate tre repliche tecniche (camere 1-3) e un pozzo di controllo (4) di SCFM2 inoculato senza trattamento antibiotico. Gli aggregati vengono ripresi utilizzando CLSM nel corso di 18 ore. (C) Dopo l’imaging iniziale di 18 ore, gli aggregati vengono trattati con ioduro di propidio per visualizzare le cellule morte e ripresi utilizzando CLSM (D) Gli aggregati con fenotipo desiderato vengono separati da SCFM2 utilizzando FACS. Abbreviazioni: SCFM2 = mezzo espettorato sintetico della fibrosi cistica; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopia a scansione laser confocale; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Qui, viene dimostrata l’utilità di SCFM2 per studiare l’impatto del trattamento antibiotico sugli aggregati di Pa in tempo reale, seguita dall’uso di un approccio di ordinamento cellulare per isolare popolazioni di aggregati con fenotipi distinti per l’analisi a valle (Figura 1).

Protocol

1. Preparare il mezzo sintetico per la fibrosi cistica (SCFM2) NOTA: La preparazione di SCFM2 comprende tre fasi principali descritte di seguito (Figura 2). Per i dettagli completi e i riferimenti, vedere9,10,12. <strong class="xf…

Representative Results

Questo lavoro descrive i metodi per osservare gli aggregati di Pa ad alta risoluzione e in un ambiente simile a quello dell’infezione cronica del polmone CF9,10,12. SCFM2 fornisce un sistema in vitro che promuove l’aggregazione naturale delle cellule Pa in dimensioni simili a quelle osservate durante l’infezione effettiva10. L’adattabilità di SCFM2 come mezzo definito può esse…

Discussion

Questo lavoro ha introdotto metodologie che possono essere combinate per studiare le popolazioni di aggregati batterici in presenza e assenza di trattamento antibiotico. ClSM ad alta risoluzione consente la visualizzazione dei cambiamenti nella biomassa aggregata e l’orientamento strutturale degli aggregati in tempo reale quando esposti agli antibiotici. Inoltre, le caratteristiche fisiche e strutturali della biomassa che rimangono dopo il trattamento con antibiotici possono essere quantificate, con l’obiettivo di correl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.E.D è supportato da fondi di start-up forniti dal Dipartimento di Medicina Molecolare, The University of South Florida, nonché da una borsa di ricerca CFF (DARCH19G0), dal N.I.H (5R21AI147654 – 02 (PI, Chen)) e dall’USF Institute on Microbiomes. Ringraziamo il laboratorio whiteley per la collaborazione in corso che coinvolge set di dati relativi a questo manoscritto. Ringraziamo il Dr. Charles Szekeres per aver facilitato lo smistamento FACS. Le figure sono state create da A.D.G e S.E.D utilizzando Biorender.com.

Materials

Amino acids
Alanine AcrEquation 1s Organics 56-41-7
Arginine HCl MP 1119-34-2
Asparagine AcrEquation 1s Organics 56-84-8 Prepared in 0.5 M NaOH
Cystine HCl Alfa Aesar L06328
Glutamic acid HCl AcrEquation 1s Organics 138-15-8
Glycine AcrEquation 1s Organics 56-40-6
Histidine HCl H2O Alfa Aesar A17627
Isoleucine AcrEquation 1s Organics 73-32-5
Leucine Alfa Aesar A12311
Lysine HCl Alfa Aesar J62099
Methionine AcrEquation 1s Organics 63-68-3
Ornithine HCl Alfa Aesar A12111
Phenylalanine AcrEquation 1s Organics 63-91-2
Proline Alfa Aesar A10199
Serine Alfa Aesar A11179
Threonine AcrEquation 1s Organics 72-19-5
Tryptophan AcrEquation 1s Organics 73-22-3 Prepared in 0.2 M NaOH
Tyrosine Alfa Aesar A11141 Prepared in 1.0 M NaOH
Valine AcrEquation 1s Organics 72-18-4
Antibiotic
Carbenicillin Alfa Aesar J6194903
Day-of Stocks
CaCl2 * 2H2O Fisher Chemical C79-500
Dextrose (D-glucose) Fisher Chemical 50-99-7
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Fisher (Avanti Polar Lipids) 4235-95-4 shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform
FeSO4 * 7H2O AcrEquation 1s Organics 7782-63-0 this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh
L-lactic acid Alfa Aesar L13242 pH stock to 7 with NaOH
MgCl2 * 6H2O AcrEquation 1s Organics 7791-18-6
N-acetylglucosamine  TCI A0092
Prepared solids
Porcine mucin Sigma M1778-100G UV-sterilize
Salmon sperm DNA Invitrogen 15632-011
Stain
Propidium iodide Alfa Aesar J66764MC
Salts
K2SO4 Alfa Aesar A13975
KCl Alfa Aesar J64189 add solid directly to buffered base
KNO3 AcrEquation 1s Organics 7757-79-1
MOPS Alfa Aesar A12914 add solid directly to buffered base
NaCl Fisher Chemical S271-500 add solid directly to buffered base
Na2HPO4 RPI S23100-500.0
NaH2PO4 RPI S23120-500.0
NH4Cl AcrEquation 1s Organics 12125-02-9 add solid directly to buffered base
Consumables
Conical tubes (15 mL) Olympus plastics 28-101
Conical tubes (50 mL) Olympus plastics 28-106
Culture tubes w/air flow cap Olympus plastics 21-129
35 mm four chamber glass-bottom dish CellVis NC0600518
Luria Bertani (LB) broth Genessee Scientific 11-118
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Bioreagents BP2944100
Pipet tips (p200) Olympus plastics 23-150RL
Pipet tips (p1000) Olympus plastics 23-165RL
Serological pipets (5 mL) Olympus plastics 12-102
Serological pipets (25 mL) Olympus plastics 12-106
Serological pipets (50 mL) Olympus plastics 12-107
Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water Genessee Scientific 18-194 Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1
Syringes (10  mL) BD 794412
Syringes (50 mL) BD 309653
0.22 mm PES syringe filter Olympus plastics 25-244
PS cuvette semi-mico Olympus plastics 91-408
Software
Biorender To prepare the figures
FacsDiva6.1.3 Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris Bitplane version 9.6
Zen Black
Equipment
FacsAriallu Becton Dickinson, San Jose, CA
LSM 880 confocal laser scanning microscope Zeiss

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Cite This Article
Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model. J. Vis. Exp. (170), e62420, doi:10.3791/62420 (2021).

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