Summary

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

Published: April 06, 2021
doi:

Summary

ניתן להשתמש במדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) בשילוב עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות כדי לצפות באגרגטים חיידקיים ברזולוציה גבוהה. מאמר זה מפרט שיטות להערכת אוכלוסיות מצטברות במהלך טיפול מיקרוביאלי כפלטפורמה למחקרים עתידיים.

Abstract

פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא אחד הפתוגנים האופורטוניסטיים הנפוצים ביותר הקשורים סיסטיק פיברוזיס (CF). ברגע שהקולוניזציה של הרשות הפלסטינית נקבעת, חלק גדול מהחיידקים הנגועים יוצרים ביופילמים בתוך כיח דרכי הנשימה. Pa biofilms מבודד כיח CF הוכח לגדול אגרגטים קטנים, צפופים של ~ 10-1,000 תאים כי הם מאורגנים מרחבית ולהציג פנוטיפים רלוונטיים קלינית כגון סובלנות מיקרוביאלית. אחד האתגרים הגדולים ביותר בחקר האופן שבו אגרגטים של הרשות הפלסטינית מגיבים לסביבת הכיח המשתנה הוא היעדר מערכות רלוונטיות וחזקות מבחינה תזונתית המקדמות היווצרות מצטברת. באמצעות מדיום כיח CF סינתטי (SCFM2), ניתן לראות את היסטוריית החיים של אגרגטים Pa באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר confocal (CLSM) וניתוח תמונה ברזולוציה של תא אחד. מערכת במבחנה זו מאפשרת התבוננות באלפי אגרגטים בגדלים משתנים בזמן אמת, בשלושה ממדים ובקנה מידה מיקרון. ברמות הפרט והאוכלוסייה, היכולת לקבץ אגרגטים לפי פנוטיפ ומיקום מאפשרת תצפית של אגרגטים בשלבים התפתחותיים שונים ותגובתם לשינויים במיקרו-סביבה, כגון טיפול אנטיביוטי, יובדלו בדיוק.

Introduction

פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא פתוגן אופורטוניסטי המבסס זיהומים כרוניים אצל אנשים שנפגעו ממערכת החיסון. עבור אלה עם המחלה הגנטית סיסטיק פיברוזיס (CF), זיהומים אלה יכולים להתפרש במהלך החיים. CF גורם להצטברות של כיח צמיג, עשיר בחומרים מזינים בדרכי הנשימה, אשר הופך קולוניאלי על ידי מגוון רחב של פתוגנים מיקרוביאליים לאורך זמן. Pa הוא אחד הפתוגנים הנפוצים ביותר CF, ליישב את דרכי הנשימה בגיל הרך ולהקים זיהומים קשים לטיפול1. הרשות הפלסטינית נותרהבעיהקלינית משמעותית ונחשבת לסיבה מובילה לתמותה אצל בעלי CF, למרות משטרי טיפול משופרים בשנים האחרונות 2,3. פנוטיפ התמדה זה וסובלנות אנטיביוטית גוברת זיכו את אבא במקום בקבוצת פתוגנים שזוהו הן על ידי המרכז לבקרת מחלות (CDC) והן על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) כסדרי עדיפויות מחקריים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות – פתוגנים ESKAPE4.

כמו פתוגנים אחרים ESKAPE, עמידות לאנטיביוטיקה נרכשת נפוצה ברשות הפלסטינית, אבל יש גם תכונות מהותיות רבות התורמות Pa סובלנות מיקרוביאלית. בין אלה היא היכולת של הרשות הפלסטינית ליצור אשכולות צפופים מאוד של ~ 10-1,000 תאים, אשר ניתן לראות בזיהומים מרובים, כולל כיח חולה CF5,6. בדומה ל-Pa שנחקרה במערכות ביופילם אחרות, אגרגטים של הרשות מציגים פנוטיפים רלוונטיים קלינית כגון עמידות מוגברת לאנטיביוטיקה והפעלה של תקשורת תאית (חישת מניין (QS)). לדוגמה, אגרגטים של Pa הוכחו להשתמש בהתנהגויות מוסדר QS כדי להילחם חיידקים אחרים, כמו גם לסבול טיפולים מיקרוביאלית כגון הייצור של פיוצינין7. היכולת לחקור התנהגויות כאלה מציעה תובנה מרגשת על מערכות אקולוגיות חיידקיות בסביבה דומה לזו שבה הן קיימות בגוף האדם.

אחד האתגרים הגדולים ביותר בחקר האופן שבו אגרגטים של הרשות הפלסטינית מגיבים לסביבת הכיח המשתנה הוא היעדר מערכות רלוונטיות וחזקות מבחינה תזונתית המקדמות היווצרות מצטברת. הרבה ממה שידוע על אבא התגלה באמצעות מערכות במבחנה שבהן תאים גדלים פלנקטונית או בארכיטקטורה אופיינית המחוברת לפני השטח, “פטריות” שלא נצפתה ב- vivo8. בעוד שמודלים קלאסיים לצמיחה של ביופילם, כגון תאי זרימה או אגר מוצק, הניבו ידע נרחב ויקר ערך על התנהגויות חיידקים ומנגנונים של סובלנות אנטיביוטית, ממצאים אלה לא תמיד מתורגמים ב- vivo. מודלים במבחנה רבים יש יכולת מוגבלת לחקות את סביבת הצמיחה של אתר הזיהום האנושי, המחייב יקר במחקרים vivo. בתורו, דגמים רבים ב- vivo חסרים את הגמישות והרזולוציה המוענקות על ידי טכניקות במבחנה.

כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) נועד לספק סביבה לצמיחת Pa דומה לזו שחוו במהלך זיהום כרוני בריאת CF. SCFM2 כולל מקורות תזונתיים שזוהו CF סייחה צפויה בנוסף mucin, שומנים, ו- DNA. צמיחת הרשות הפלסטינית ב- SCFM2 דורשת גן כמעט זהה לזה הנדרש לצמיחה בליחה בפועל ותומכת במבנה טבעי של הרשות הפלסטינית 9,10. לאחר החיסון, תאים פלנקטוניים יוצרים אגרגטים הגדלים בגודלם באמצעות התרחבות. תאים בודדים (המכונים מהגרים) משתחררים מצבירה, נודדים לאזורים לא נוסעים ויוצרים אגרגטים חדשים10. ניתן לצפות בהיסטוריית חיים זו באמצעות CLSM וניתוח תמונה ברזולוציה של תא בודד. אגרגטים של Pa שנוצר ב- SCFM2 הם בגדלים דומים לאלה שנצפו בריאת CF10. מודל זה מאפשר תצפית של אגרגטים מרובים בגודל משתנה בזמן אמת ובשלושה ממדים בקנה המידה המיקרוני. מיקרוסקופיה של זמן-לשגות מאפשרת מעקב אחר אלפי אגרגטים (כ-50,000) בניסוי אחד. השימוש בתוכנת ניתוח תמונה מאפשר כימות של פנוטיפים מצטברים ממיקרוגרפים, כולל נפח מצטבר, שטח פנים ומיקום בשלושה ממדים ל- 0.1 מיקרומטר הקרוב ביותר, הן במצטבר האישי והן ברמת האוכלוסייה. לאחר היכולת לקבץ אגרגטים לפי פנוטיפ ומיקום מאפשרת הבחנה של אגרגטים בשלבים התפתחותיים שונים עם דיוק, כמו גם את תגובתם microenvironment משתנה6,11.

היישום של SCFM2 ללמוד אגרגטים Pa בנפח נמוך ובוחות תפוקה גבוהה להפוך אותו מודל גמיש, חסכוני. כמדיום מוגדר, SCFM2 מציע אחידות ושחזור על פני פלטפורמות מרובות, מתן שיטה רלוונטית מבחינה תזונתית ופיזית ללמוד אגרגטים Pa במבחנה9. היישומים כוללים את השימוש בו בשילוב עם CLSM כדי לבחון ארגון מרחבי וסובלנות אנטיביוטית ברזולוציה גבוהה (כמתואר בנייר שיטות זה). היכולת לבצע ניסויים המספקים נתונים בקנה מידה מיקרוני בזמן אמת מאפשרת לחקור אינטראקציות בין מינים ובין מינים כפי שהם עשויים להתרחש ב vivo. לדוגמה, SCFM2 שימש בעבר כדי ללמוד את הדינמיקה המרחבית של תקשורת תא-תאים באוכלוסיות צבירה באמצעות רשת של מערכות המשמשות את הרשות הפלסטינית כדי לווסת גנים מרובים התורמים virulence ופתוגנזה6.

Figure 1
איור 1: תיאור גרפי של השלבים הניסיוניים העיקריים. (A)SCFM2 מחוסן בתאי Pa ומותר ליצור אגרגטים בצלחת תרבות עם תחתית זכוכית. (B)אגרגטים מועברים למיקרוסקופ הקונפוקלי, ומתווסף אנטיביוטיקה. מתוארים שלושה העתקים טכניים (תאים 1-3) ובאר שליטה (4) של SCFM2 מחוסן ללא טיפול אנטיביוטי. אגרגטים מצולם באמצעות CLSM במהלך 18 שעות. (C) לאחר ההדמיה הראשונית של 18 שעות, אגרגטים מטופלים עם פרופיל יודיד כדי לדמיין תאים מתים ותמונה באמצעות CLSM (D)אגרגטים עם פנוטיפ הרצוי מופרדים SCFM2 באמצעות FACS. קיצורים: SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סינתטי כיח בינוני; Pa = פסאודומונס ארוגינוזה; CLSM = מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית; FACS = מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כאן, השירות של SCFM2 כדי לחקור את ההשפעה של טיפול אנטיביוטי על אגרגטים Pa בזמן אמת מוכח, ואחריו שימוש בגישה של מיון תאים כדי לבודד אוכלוסיות של אגרגטים עם פנוטיפים ברורים לניתוח במורד הזרם (איור 1).

Protocol

1. הכן סיסטיק פיברוזיס סינטטי בינוני (SCFM2) הערה: הכנת SCFM2 כוללת שלושה שלבים עיקריים המפורטים להלן (איור 2). לפרטים מלאים והאזכורים, ראה9,10,12. <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62420/6242…

Representative Results

עבודה זו מפרטת שיטות להתבונן אגרגטים Pa ברזולוציה גבוהה ובסביבה דומה לזו של זיהום כרוני של CFריאה 9,10,12. SCFM2 מספק מערכת במבחנה המקדמת צבירה טבעית של תאי Pa בגדלים דומים לאלה שנצפו במהלך זיהום בפועל10. ניתן למנף את יכ?…

Discussion

עבודה זו הציגה מתודולוגיות שניתן לשלב כדי לחקור אוכלוסיות צבירה חיידקיות בנוכחות ובהיעדר טיפול אנטיביוטי. CLSM ברזולוציה גבוהה מאפשר הדמיה של שינויים ביומסה מצטברת ואת הכיוון המבני של אגרגטים על פני זמן אמת כאשר נחשף לאנטיביוטיקה. בנוסף, ניתן לכמת תכונות פיזיות ומבניות של הביומסה שנותרו ל…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.E.D נתמך על ידי קרנות סטארט-אפ המסופקות על ידי המחלקה לרפואה מולקולרית, אוניברסיטת דרום פלורידה, כמו גם מענק מחקר CFF (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 – 02 (PI, חן)) ומכון USF על מיקרוביום. אנו מודים למעבדת ויטלי על שיתוף הפעולה המתמשך הכולל ערכות נתונים הקשורות לכתב יד זה. אנו מודים לד”ר צ’ארלס סקרס על שטיפל במיון של FACS. דמויות נוצרו על ידי A.D.G וS.E.D. באמצעות Biorender.com.

Materials

Amino acids
Alanine AcrEquation 1s Organics 56-41-7
Arginine HCl MP 1119-34-2
Asparagine AcrEquation 1s Organics 56-84-8 Prepared in 0.5 M NaOH
Cystine HCl Alfa Aesar L06328
Glutamic acid HCl AcrEquation 1s Organics 138-15-8
Glycine AcrEquation 1s Organics 56-40-6
Histidine HCl H2O Alfa Aesar A17627
Isoleucine AcrEquation 1s Organics 73-32-5
Leucine Alfa Aesar A12311
Lysine HCl Alfa Aesar J62099
Methionine AcrEquation 1s Organics 63-68-3
Ornithine HCl Alfa Aesar A12111
Phenylalanine AcrEquation 1s Organics 63-91-2
Proline Alfa Aesar A10199
Serine Alfa Aesar A11179
Threonine AcrEquation 1s Organics 72-19-5
Tryptophan AcrEquation 1s Organics 73-22-3 Prepared in 0.2 M NaOH
Tyrosine Alfa Aesar A11141 Prepared in 1.0 M NaOH
Valine AcrEquation 1s Organics 72-18-4
Antibiotic
Carbenicillin Alfa Aesar J6194903
Day-of Stocks
CaCl2 * 2H2O Fisher Chemical C79-500
Dextrose (D-glucose) Fisher Chemical 50-99-7
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Fisher (Avanti Polar Lipids) 4235-95-4 shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform
FeSO4 * 7H2O AcrEquation 1s Organics 7782-63-0 this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh
L-lactic acid Alfa Aesar L13242 pH stock to 7 with NaOH
MgCl2 * 6H2O AcrEquation 1s Organics 7791-18-6
N-acetylglucosamine  TCI A0092
Prepared solids
Porcine mucin Sigma M1778-100G UV-sterilize
Salmon sperm DNA Invitrogen 15632-011
Stain
Propidium iodide Alfa Aesar J66764MC
Salts
K2SO4 Alfa Aesar A13975
KCl Alfa Aesar J64189 add solid directly to buffered base
KNO3 AcrEquation 1s Organics 7757-79-1
MOPS Alfa Aesar A12914 add solid directly to buffered base
NaCl Fisher Chemical S271-500 add solid directly to buffered base
Na2HPO4 RPI S23100-500.0
NaH2PO4 RPI S23120-500.0
NH4Cl AcrEquation 1s Organics 12125-02-9 add solid directly to buffered base
Consumables
Conical tubes (15 mL) Olympus plastics 28-101
Conical tubes (50 mL) Olympus plastics 28-106
Culture tubes w/air flow cap Olympus plastics 21-129
35 mm four chamber glass-bottom dish CellVis NC0600518
Luria Bertani (LB) broth Genessee Scientific 11-118
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Bioreagents BP2944100
Pipet tips (p200) Olympus plastics 23-150RL
Pipet tips (p1000) Olympus plastics 23-165RL
Serological pipets (5 mL) Olympus plastics 12-102
Serological pipets (25 mL) Olympus plastics 12-106
Serological pipets (50 mL) Olympus plastics 12-107
Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water Genessee Scientific 18-194 Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1
Syringes (10  mL) BD 794412
Syringes (50 mL) BD 309653
0.22 mm PES syringe filter Olympus plastics 25-244
PS cuvette semi-mico Olympus plastics 91-408
Software
Biorender To prepare the figures
FacsDiva6.1.3 Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris Bitplane version 9.6
Zen Black
Equipment
FacsAriallu Becton Dickinson, San Jose, CA
LSM 880 confocal laser scanning microscope Zeiss

References

  1. Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
  2. Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
  3. Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
  4. O’Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
  5. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  6. Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
  7. Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
  8. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
  9. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  10. Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
  11. Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
  12. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  13. Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
  14. Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
  15. Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model. J. Vis. Exp. (170), e62420, doi:10.3791/62420 (2021).

View Video