Summary

أدوات للتقييم في الوقت الحقيقي لنموذج عدوى السودوموناس aeruginosa

Published: April 06, 2021
doi:

Summary

الاصطناعية التليف الكيسي البلغم المتوسطة (SCFM2) يمكن استخدامها في تركيبة مع كل من الليزر confocal المسح المجهري والفلورسينس تنشيط فرز الخلايا لمراقبة المجاميع البكتيرية في قرار عالية. تفصل هذه الورقة طرق تقييم المجموعات السكانية الإجمالية أثناء العلاج المضاد للميكروبات كمنصة للدراسات المستقبلية.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (Pa) هي واحدة من مسببات الأمراض الانتهازية الأكثر شيوعا المرتبطة بالتليف الكيسي (CF). بمجرد تأسيس استعمار السلطة الفلسطينية ، تشكل نسبة كبيرة من البكتيريا المصابة الأغشية الحيوية داخل بغم مجرى الهواء. وقد ثبت أن الأغشية الحيوية Pa المعزولة عن البلغم CF تنمو في مجاميع صغيرة وكثيفة من ~ 10-1000 خلية يتم تنظيمها مكانيا وتظهر الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا مثل تحمل مضادات الميكروبات. أحد أكبر التحديات لدراسة كيفية استجابة مجاميع Pa لبيئة البلغم المتغيرة هو عدم وجود أنظمة ذات صلة من الناحية التغذوية وقوية تعزز التكوين الكلي. باستخدام وسيطة البلغم CF الاصطناعية (SCFM2)، يمكن ملاحظة تاريخ حياة المجاميع السلطة الفلسطينية باستخدام المجهر المسح بالليزر confocal (CLSM) وتحليل الصور في قرار خلية واحدة. يسمح هذا النظام في المختبر بمراقبة آلاف المجاميع ذات الحجم المتفاوت في الوقت الحقيقي وثلاثة أبعاد وعلى مقياس ميكرون. وعلى المستويين الفردي والسكاني، فإن القدرة على تجميع المجاميع حسب النمط الظاهري والموقع تسهل مراقبة المجاميع في مراحل النمو المختلفة واستجابتها للتغيرات في البيئة الدقيقة، مثل العلاج بالمضادات الحيوية، التي يمكن تمييزها بدقة.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (Pa) هو ممرض انتهازي يؤسس التهابات مزمنة في الأفراد الذين يتعرضون للخطر المناعي. بالنسبة لأولئك الذين يعانون من التليف الكيسي المرض الوراثي (CF)، يمكن لهذه العدوى تمتد على مدى العمر. CF يسبب تراكم البلغم لزجة وغنية بالمغذيات في الشعب الهوائية، والتي تصبح مستعمرة من قبل مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض الميكروبية مع مرور الوقت. السلطة الفلسطينية هي واحدة من مسببات الأمراض CF الأكثر انتشارا، واستعمار الشعب الهوائية في مرحلة الطفولة المبكرة وإنشاء العدوى التي يصعب علاجها1. السلطة الفلسطينية لا تزال مشكلة سريرية كبيرة ويعتبر السبب الرئيسي للوفيات في أولئك الذين يعانون من CF, على الرغم من تحسين نظم العلاج في السنوات الأخيرة2,3. وقد أكسب هذا النمط الظاهري المستمر وزيادة تحمل المضادات الحيوية Pa مكانا في مجموعة من مسببات الأمراض التي حددها كل من مراكز مكافحة الأمراض (CDC) ومنظمة الصحة العالمية (WHO) كأولويات بحثية لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة – مسببات الأمراض ESKAPE4.

مثل مسببات الأمراض الأخرى ESKAPE، اكتسبت مقاومة المضادات الحيوية أمر شائع في السلطة الفلسطينية،ولكن هناك أيضا العديد من الخصائص الجوهرية التي تسهم في التسامح Pa مضادات الميكروبات. من بين هذه هي قدرة السلطة الفلسطينية لتشكيل مجموعات المجاميع كثيفة للغاية من ~ 10-1000 الخلايا، والتي يمكن ملاحظتها في التهابات متعددة، بما في ذلك CF البلغم المريض5،6. على غرار Pa التي تمت دراستها في أنظمة بيو فيلم أخرى ، تعرض مجاميع Pa الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا مثل زيادة مقاومة المضادات الحيوية وتنشيط الاتصالات الخلوية الخلية (استشعار النصاب القانوني (QS)). على سبيل المثال، وقد ثبت أن المجاميع من السلطة الفلسطينية لاستخدام السلوكيات QS التي تنظمها لمكافحة الميكروبات الأخرى، فضلا عن تحمل العلاجات المضادة للميكروبات مثل إنتاج البايوسيانين7. القدرة على دراسة مثل هذه السلوكيات يقدم نظرة مثيرة في النظم الإيكولوجية البكتيرية في بيئة مماثلة لتلك التي توجد في جسم الإنسان.

أحد أكبر التحديات لدراسة كيفية استجابة مجاميع Pa لبيئة البلغم المتغيرة هو عدم وجود أنظمة ذات صلة من الناحية التغذوية وقوية تعزز التكوين الكلي. وقد تم اكتشاف الكثير مما هو معروف عن السلطة الفلسطينية باستخدام النظم المختبرية التي تنمو الخلايا العوالق أو في سطح مميز المرفقة، “الفطر” العمارة التي لم يلاحظ في الجسم الحي8. في حين أن نماذج نمو البيو فيلم الكلاسيكية، مثل خلايا التدفق أو أجار الصلبة، قد أسفرت عن معرفة واسعة وقيمة حول السلوكيات البكتيرية وآليات التسامح مع المضادات الحيوية، وهذه النتائج لا تترجم دائما في الجسم الحي. العديد من النماذج في المختبر لديها قدرة محدودة على محاكاة بيئة النمو في موقع العدوى البشرية، مما يتطلب مكلفة في الدراسات الحية. بدوره، يفتقر العديد من نماذج الجسم الحي إلى المرونة والدقة التي توفرها التقنيات المختبرية.

تم تصميم البلغم التليف الكيسي الاصطناعية (SCFM2) لتوفير بيئة لنمو السلطة الفلسطينية مماثلة لتلك التي شهدتها خلال العدوى المزمنة في الرئة CF. SCFM2 يشمل المصادر الغذائية المحددة في sputa CF المتوقعة بالإضافة إلى الموسين والدهون والحمض النووي. السلطة الفلسطينية النمو في SCFM2 يتطلب مجموعة الجينات متطابقة تقريبا لتلك المطلوبة للنمو في البلغم الفعلي ويدعم الطبيعية السلطة الفلسطينية تشكيل الكلي9,10. بعد التطعيم، تشكل الخلايا العوالق مجاميع تزيد في الحجم من خلال التوسع. يتم تحرير الخلايا الفردية (يشار إليها باسم المهاجرين) من المجاميع، والهجرة إلى مناطق غير مستعمرة، وتشكيل مجاميع جديدة10. يمكن ملاحظة تاريخ الحياة هذا باستخدام CLSM وتحليل الصورة بدقة خلية واحدة. المجاميع من السلطة الفلسطينية التي تشكلت في SCFM2 هي من أحجام مماثلة لتلك التي لوحظت في الرئة CF10. يسمح هذا النموذج بمراقبة مجاميع متعددة ذات حجم مختلف في الوقت الفعلي وفي ثلاثة أبعاد على مقياس ميكرون. يسمح الفحص المجهري الفاصل زمنيا بتتبع الآلاف (حوالي 50,000) من المجاميع في تجربة واحدة. يسمح استخدام برنامج تحليل الصور بتقدير الأنماط الظاهرية الكلية من الصور الدقيقة، بما في ذلك الحجم الكلي والمساحة السطحية والموقع في ثلاثة أبعاد لأقرب 0.1 ميكرومتر، على مستوى التجميع الفردي والسكان على حد سواء. وجود القدرة على تجميع المجاميع حسب النمط الظاهري والموقف يسمح لتمايز المجاميع في مراحل النمو المختلفة بدقة ، فضلا عن استجابتها للبيئة الدقيقة المتغيرة6،11.

تطبيق SCFM2 لدراسة المجاميع السلطة الفلسطينية في حجم منخفض وأعلى الإنتاجية المقايسات جعله نموذجا مرنا وفعالا من حيث التكلفة. كوسيط محدد، يوفر SCFM2 التوحيد والتكرار عبر منصات متعددة، وتوفير طريقة ذات صلة من الناحية التغذوية والبدنية لدراسة المجاميع السلطة الفلسطينية في المختبر9. وتشمل التطبيقات استخدامه في تركيبة مع CLSM لمراقبة التنظيم المكاني والتسامح مع المضادات الحيوية بدقة عالية (كما هو موضح في ورقة الأساليب هذه). القدرة على إجراء التجارب التي توفر في الوقت الحقيقي، والبيانات على نطاق ميكرون يسمح لدراسة التفاعلات داخل الأنواع وبين الأنواع لأنها قد تحدث في الجسم الحي. على سبيل المثال، سبق استخدام SCFM2 لدراسة الديناميات المكانية للاتصال بين الخلايا في مجموعات سكانية إجمالية عبر شبكة من الأنظمة التي تستخدمها السلطة الفلسطينية لتنظيم الجينات المتعددة التي تساهم في الفوعة ومسببات الأمراض6.

Figure 1
الشكل 1: تصوير رسومية من الخطوات التجريبية الرئيسية. (أ) يتم تلقيح SCFM2 مع خلايا السلطة الفلسطينية ويسمح لتشكيل المجاميع في طبق ثقافة الزجاج القاع. (ب)يتم نقل المجاميع إلى المجهر confocal، ويتم إضافة المضادات الحيوية. يصور ثلاثة تكرارات تقنية (الغرف 1-3) وبخير تحكم (4) من SCFM2 الملقح دون علاج بالمضادات الحيوية. يتم تصوير المجاميع باستخدام CLSM على مدار 18 ساعة (C) بعد التصوير الأولي 18 ساعة ، يتم التعامل مع المجاميع مع يوديد البروبيديوم لتصور الخلايا الميتة وتصويرها باستخدام CLSM (D) يتم فصل المجاميع مع النمط الظاهري المطلوب من SCFM2 باستخدام FACS. الاختصارات: SCFM2 = الاصطناعية التليف الكيسي البلغم المتوسط; السلطة الفلسطينية = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = المسح المجهري بالليزر confocal؛ FACS = فرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هنا ، يتم إثبات فائدة SCFM2 لدراسة تأثير العلاج بالمضادات الحيوية على مجاميع Pa في الوقت الفعلي ، يليها استخدام نهج فرز الخلايا لعزل مجموعات المجاميع ذات الأنماط الظاهرية المتميزة لتحليل المصب(الشكل 1).

Protocol

1. إعداد الاصطناعية التليف الكيسي المتوسط (SCFM2) ملاحظة: يتضمن إعداد SCFM2 ثلاث مراحل رئيسية موضحة أدناه (الشكل 2). للاطلاع على التفاصيل والمراجع الكاملة، انظر9و10و12. <img alt="Figure 2" class=…

Representative Results

هذا العمل تفاصيل أساليب لمراقبة المجاميع السلطة الفلسطينية في قرار عالية وفي بيئة مماثلة لتلك التي من العدوى المزمنة في الرئة CF9,10,12. يوفر SCFM2 نظام المختبر الذي يعزز التجميع الطبيعي للخلايا السلطة الفلسطينية في أحجام مماثل?…

Discussion

وقد أدخل هذا العمل منهجيات يمكن دمجها لدراسة المجموعات البكتيرية الإجمالية في وجود وغياب العلاج بالمضادات الحيوية. تسمح CLSM عالية الدقة بتصور التغيرات في الكتلة الحيوية الكلية والتوجه الهيكلي للمجاميع في الوقت الفعلي عند التعرض للمضادات الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس السمات الفي?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويدعم S.E.D من قبل صناديق بدء التشغيل التي تقدمها وزارة الطب الجزيئي، وجامعة جنوب فلوريدا، فضلا عن منحة بحثية CFF (DARCH19G0) وN.I.H (5R21AI147654 – 02 (PI، تشن)) ومعهد USF على الميكروبيوم. نشكر مختبر وايتلي على التعاون المستمر الذي يشمل مجموعات البيانات المتعلقة بهذه المخطوطة. نشكر الدكتور تشارلز Szekeres لتسهيل فرز FACS. تم إنشاء الأرقام من قبل A.D.G و S.E.D باستخدام Biorender.com.

Materials

Amino acids
Alanine AcrEquation 1s Organics 56-41-7
Arginine HCl MP 1119-34-2
Asparagine AcrEquation 1s Organics 56-84-8 Prepared in 0.5 M NaOH
Cystine HCl Alfa Aesar L06328
Glutamic acid HCl AcrEquation 1s Organics 138-15-8
Glycine AcrEquation 1s Organics 56-40-6
Histidine HCl H2O Alfa Aesar A17627
Isoleucine AcrEquation 1s Organics 73-32-5
Leucine Alfa Aesar A12311
Lysine HCl Alfa Aesar J62099
Methionine AcrEquation 1s Organics 63-68-3
Ornithine HCl Alfa Aesar A12111
Phenylalanine AcrEquation 1s Organics 63-91-2
Proline Alfa Aesar A10199
Serine Alfa Aesar A11179
Threonine AcrEquation 1s Organics 72-19-5
Tryptophan AcrEquation 1s Organics 73-22-3 Prepared in 0.2 M NaOH
Tyrosine Alfa Aesar A11141 Prepared in 1.0 M NaOH
Valine AcrEquation 1s Organics 72-18-4
Antibiotic
Carbenicillin Alfa Aesar J6194903
Day-of Stocks
CaCl2 * 2H2O Fisher Chemical C79-500
Dextrose (D-glucose) Fisher Chemical 50-99-7
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Fisher (Avanti Polar Lipids) 4235-95-4 shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform
FeSO4 * 7H2O AcrEquation 1s Organics 7782-63-0 this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh
L-lactic acid Alfa Aesar L13242 pH stock to 7 with NaOH
MgCl2 * 6H2O AcrEquation 1s Organics 7791-18-6
N-acetylglucosamine  TCI A0092
Prepared solids
Porcine mucin Sigma M1778-100G UV-sterilize
Salmon sperm DNA Invitrogen 15632-011
Stain
Propidium iodide Alfa Aesar J66764MC
Salts
K2SO4 Alfa Aesar A13975
KCl Alfa Aesar J64189 add solid directly to buffered base
KNO3 AcrEquation 1s Organics 7757-79-1
MOPS Alfa Aesar A12914 add solid directly to buffered base
NaCl Fisher Chemical S271-500 add solid directly to buffered base
Na2HPO4 RPI S23100-500.0
NaH2PO4 RPI S23120-500.0
NH4Cl AcrEquation 1s Organics 12125-02-9 add solid directly to buffered base
Consumables
Conical tubes (15 mL) Olympus plastics 28-101
Conical tubes (50 mL) Olympus plastics 28-106
Culture tubes w/air flow cap Olympus plastics 21-129
35 mm four chamber glass-bottom dish CellVis NC0600518
Luria Bertani (LB) broth Genessee Scientific 11-118
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Bioreagents BP2944100
Pipet tips (p200) Olympus plastics 23-150RL
Pipet tips (p1000) Olympus plastics 23-165RL
Serological pipets (5 mL) Olympus plastics 12-102
Serological pipets (25 mL) Olympus plastics 12-106
Serological pipets (50 mL) Olympus plastics 12-107
Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water Genessee Scientific 18-194 Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1
Syringes (10  mL) BD 794412
Syringes (50 mL) BD 309653
0.22 mm PES syringe filter Olympus plastics 25-244
PS cuvette semi-mico Olympus plastics 91-408
Software
Biorender To prepare the figures
FacsDiva6.1.3 Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris Bitplane version 9.6
Zen Black
Equipment
FacsAriallu Becton Dickinson, San Jose, CA
LSM 880 confocal laser scanning microscope Zeiss

References

  1. Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
  2. Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
  3. Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
  4. O’Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
  5. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  6. Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
  7. Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
  8. Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
  9. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  10. Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
  11. Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
  12. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  13. Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
  14. Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
  15. Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gannon, A. D., Darch, S. E. Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model. J. Vis. Exp. (170), e62420, doi:10.3791/62420 (2021).

View Video