Bu protokol, Drosophila politen hücrelerindeki heterokromatin agregalarını görselleştirmeyi amaçlamaktadır.
Heterokromatin agregalarının immünostainleme ile görselleştirilmesi zor olabilir. Kromatin birçok memeli bileşeni Drosophila melanogaster’da korunur. Bu nedenle, heterokromatin oluşumunu ve bakımını incelemek için mükemmel birmodeldir. Üçüncü instar D. melanogaster larvalarının tükürük bezlerinde bulunanlar gibi politenize hücreler, yaklaşık bin kez yükseltilen kromatinleri gözlemlemek için mükemmel bir araç sağlar ve araştırmacıların çekirdekteki heterokromatin dağılımındaki değişiklikleri incelemelerine izin verir. Heterokromatin bileşenlerinin gözlemi doğrudan politen kromozom preparatlarında yapılsa da, bazı proteinlerin lokalizasyonu tedavinin şiddeti ile değiştirilebilir. Bu nedenle, hücrelerde heterokromatin’in doğrudan görselleştirilmesi bu tür bir çalışmayı tamamlar. Bu protokolde, bu doku için kullanılan immünostaining tekniklerini, sekonder floresan antikorların kullanımını ve bu heterokromatin agregalarını daha fazla hassasiyet ve ayrıntıyla gözlemlemek için konfokal mikroskopiyi açıklıyoruz.
Emil Heitz1’inilk çalışmalarından bu yana heterokromatin gen ekspresyonu, kromozomların meiotik ve mitotik ayrılması ve genom stabilitesinin korunması gibi hücresel süreçlerin önemli bir düzenleyicisi olarak kabul edilmiştir2,3,4.
Heterokromatin esas olarak iki türe ayrılır: karakteristik olarak tekrarlayan dizileri tanımlayan konsitutive heterokromatin ve telomerler ve centromeres gibi belirli kromozom bölgelerinde bulunan transpoze edilebilir elementler. Bu tür heterokromatin esas olarak H3 (H3K9me3) histone 9 lizin di veya tri-metilasyonu ve Heterokromatin proteini 1a (HP1a)5,6bağlanması gibi spesifik histone izleri ile epigenetik olarak tanımlanır. Öte yandan, öğretim üyesi heterokromatin kromozomun kollarında lokalize eder ve esas olarak gelişimsel olarak susturulmuş genlerden oluşur7,8. Metafaz hücrelerindeki heterokromatin bloklarının immünostainasyonu veya ara hücrelerdeki heterokromatin agregalarının gözlemlenmesi, heterokromatik bölgelerin oluşumu ve işlevinin anlaşılmasında çok fazla ışık ortaya çıkarmıştır9.
Drosophila’nın bir model sistemi olarak kullanılması, elektron mikroskopisi kullanmadan heterokromatin çalışması için gerekli aletlerin geliştirilmesine izin10. Pozisyon etkisi değişkenliğinin tanımlanması ve HP1a gibi heterokromatin ilişkili proteinlerin keşfi ve çeviri sonrası değişikliklerden bu yana, birçok grup bu heterokromatik bölgelerin görselleştirilmesine izin veren çeşitli immünohistokimyasal teknikler geliştirmiştir10,11.
Bu teknikler, heterokromatin ilişkili proteinleri veya histone izlerini tanıyan spesifik antikorların kullanımına dayanmaktadır. Her hücre tipi ve antikor için fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, ezme teknikleri gibi ek mekanik işlemler kullanılırsa koşullar değişebilir. Bu protokolde, heterokromatik odakları incelemek için Drosophila tükürük bezlerinin kullanımını açıklıyoruz. Tükürük bezleri, genomun 1.000’den fazla kopyasını içeren politenize hücrelere sahiptir, böylece uydu DNA’sı ve çoğaltılmış olan bazı heterokromatik bölgeler hariç, kromatin özelliklerinin çoğunun genişletilmiş bir görünümünü sağlar. Bununla birlikte, heterokromatin bölgeleri politen kromozom preparatlarında kolayca görselleştirilir, ancak kabarma teknikleri bazen karakteristik kromatin bağlı kompleksleri veya kromatin mimarisini bozabilir. Bu nedenle, tüm tükürük bezi dokusundaki proteinlerin immünolokalizasyonu bu istenmeyen etkileri aşabilir. Bu protokolü birkaç kromatin bağlı proteini tespit etmek için kullandık ve mutant Drosophila stokları ile birlikte bu protokolün heterokromatin bozulmasını incelemek için kullanılabileceğini gösterdik12.
Ökaryotik organizmaların hücresel işlevi, kromatin ile farklı proteinler ve RNA dahil olmak üzere çeşitli moleküller arasındaki etkileşimlerle desteklenen çekirdek içindeki 3D yapıyı tanımlayabilir. Son üç yılda, heterokromatin de dahil olmak üzere alaka düzeyi olan biyolojik kondensatlar, aktif ve baskıcı kromatin 16 , 17,18’inayrı nükleer mekansal organizasyonuna teşvik eden faz ayrımının belirlenm…
The authors have nothing to disclose.
Marco Antonio Rosales Vega ve Abel Segura’ya bazı konfokal görüntüleri aldıkları için, medya hazırlığı için Carmen Muñoz’a ve mikroskopların kullanımı konusunda tavsiyeler için LMNA’dan Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui ve Dr. Chris Wood’a teşekkür ederiz.
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
EGTA | brand not critical | ||
Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
NaOH | brand not critical | ||
PIPES | brand not critical | ||
Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |