Ce protocole vise à visualiser les agrégats d’hétérochromatine dans les cellules de polytène de drosophile.
La visualisation des agrégats d’hétérochromatine par immunostaining peut être provocante. De nombreux composants mammifères de la chromatine sont conservés chez Drosophila melanogaster. Par conséquent, c’est un excellent modèle pour étudier la formation et l’entretien de l’hétérochromatine. Les cellules polyténisées, telles que celles trouvées dans les glandes salivaires des larves de D. melanogaster du troisième stade, fournissent un excellent outil pour observer la chromatine amplifiée près de mille fois et ont permis aux chercheurs d’étudier les changements dans la distribution de l’hétérochromatine dans le noyau. Bien que l’observation des composants de l’hétérochromatine puisse être effectuée directement dans des préparations chromosomiques polytènes, la localisation de certaines protéines peut être modifiée par la gravité du traitement. Par conséquent, la visualisation directe de l’hétérochromatine dans les cellules complète ce type d’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les techniques immunostaining utilisées pour ce tissu, l’utilisation des anticorps fluorescents secondaires, et la microscopie confocale d’observer ces agrégats d’hétérochromatine avec une plus grande précision et détail.
Depuis les premières études d’Emil Heitz1,l’hétérochromatine a été considérée comme un régulateur important des processus cellulaires tels que l’expression des gènes, la séparation méiotique et mitotique des chromosomes et le maintien de la stabilité du génome2,3,4.
L’hétérochromatine est principalement divisée en deux types: l’hétérochromatine constitutive qui définit de manière caractéristique les séquences répétitives, et les éléments transposables qui sont présents à des sites chromosomiques spécifiques tels que les télomères et les centromères. Ce type d’hétérochromatine est principalement défini épigénétiquement par des marques d’histones spécifiques telles que la di ou tri-méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me3) et la liaison de la protéine hétérochromatine 1a (HP1a)5,6. D’autre part, l’hétérochromatine facultative se localise à travers les bras du chromosome et se compose principalement de gènes7,8. L’immunomarquage de blocs d’hétérochromatine dans les cellules métaphases, ou l’observation d’agrégats d’hétérochromatine dans les cellules interphases, a dévoilé beaucoup de lumière dans la compréhension de la formation et de la fonction des régions hétérochromatiques9.
L’utilisation de la drosophile comme système modèle a permis le développement d’outils essentiels pour étudier l’hétérochromatine sans l’utilisation de la microscopie électronique10. Depuis la description de la panachation de l’effet de position et la découverte de protéines associées à l’hétérochromatine, telles que HP1a, et de modifications post-traductionnelles des histones, de nombreux groupes ont développé plusieurs techniques immunohistochimiques qui permettent la visualisation de ces régions hétérochromatiques10,11.
Ces techniques sont basées sur l’utilisation d’anticorps spécifiques qui reconnaissent les protéines associées à l’hétérochromatine ou les marques d’histones. Pour chaque type de cellule et anticorps, les conditions de fixation et de perméabilisation doivent être déterminées empiriquement. En outre, les conditions peuvent varier si des procédés mécaniques supplémentaires tels que des techniques d’écrasement sont utilisés. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation des glandes salivaires de drosophile d’étudier les foyers hétérochromatiques. Les glandes salivaires ont des cellules polyténisées qui contiennent plus de 1 000 copies du génome, fournissant ainsi une vue amplifiée de la plupart des caractéristiques de la chromatine, à l’exception de l’ADN satellite et de certaines régions hétérochromatiques qui sont sous-répliquées. Néanmoins, les régions d’hétérochromatine sont facilement visualisées dans des préparations de chromosome de polytène, mais les techniques d’écrasement peuvent parfois perturber des complexes caractéristiques liés à la chromatine ou l’architecture de chromatine. Par conséquent, l’immunolocalisation des protéines dans le tissu entier des glandes salivaires peut dépasser ces effets indésirables. Nous avons utilisé ce protocole pour détecter plusieurs protéines liées à la chromatine, et nous avons démontré que ce protocole combiné avec des stocks de drosophile mutants peut être utilisé pour étudier la perturbation de l’hétérochromatine12.
La fonction cellulaire des organismes eucaryotes peut définir la structure 3D dans le noyau, qui est soutenue par des interactions entre différentes protéines avec la chromatine et diverses molécules, y compris l’ARN. Au cours des trois dernières années, les condensats biologiques qui ont eu de la pertinence, y compris l’hétérochromatine, ont joué un rôle fondamental dans la détermination de la séparation de phase favorisant l’organisation spatiale nucléaire distincte de la chromatine active et répres…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Marco Antonio Rosales Vega et Abel Segura d’avoir pris certaines des images confocales, Carmen Muñoz pour la préparation des médias et le Dr Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui et le Dr Chris Wood de la LMNA pour des conseils sur l’utilisation des microscopes.
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
EGTA | brand not critical | ||
Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
NaOH | brand not critical | ||
PIPES | brand not critical | ||
Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |