Иммунофлуоресцентное окрашивание для визуализации гетерохроматиновых ассоциированных белков в слюнных железах дрозофилы

Summary

Этот протокол направлен на визуализацию агрегатов гетерохроматина в клетках Drosophila polytene.

Abstract

Визуализация агрегатов гетерохроматина путем иммуноокрашивания может быть сложной задачей. Многие компоненты хроматина у млекопитающих сохраняются в Drosophila melanogaster. Поэтому это отличная модель для изучения образования и поддержания гетерохроматина. Политенизированные клетки, такие как те, которые обнаружены в слюнных железах личинок третьей звезды D. melanogaster, обеспечивают отличный инструмент для наблюдения за усилением хроматина почти в тысячу раз и позволили исследователям изучить изменения в распределении гетерохроматина в ядре. Хотя наблюдение за компонентами гетерохроматина может проводиться непосредственно в политеновых хромосомных препаратах, локализация некоторых белков может быть изменена тяжестью лечения. Поэтому прямая визуализация гетерохроматина в клетках дополняет этот вид исследования. В этом протоколе мы описываем методы иммуноокрашения, используемые для этой ткани, использование вторичных флуоресцентных антител и конфокальную микроскопию для наблюдения этих гетерохроматиновых агрегатов с большей точностью и детализацией.

Introduction

Начиная с ранних исследований Эмиля Хайца^1,гетерохроматин считался важным регулятором клеточных процессов, таких как экспрессия генов, мейотическое и митотическое разделение хромосом и поддержание стабильности генома^2,3,4.

Гетерохроматин в основном делится на два типа: конститутивный гетерохроматин, который характерно определяет повторяющиеся последовательности, и транспонируемые элементы, которые присутствуют в определенных участках хромосом, таких как теломеры и центромеры. Этот тип гетерохроматина в основном определяется эпигенетически специфическими гистоновыми метками, такими как ди- или триметилирование лизина 9 гистона H3 (H3K9me3) и связывание белка гетерохроматина 1a (HP1a)^5,6. С другой стороны, факультативный гетерохроматин локализуется через руки хромосомы и состоит в основном из генов, заглушающих развитие^7,8. Иммуноокрашивание блоков гетерохроматина в метафазных клетках или наблюдение за агрегатами гетерохроматина в межфазных клетках открыло много света в понимании формирования и функции гетерохроматических областей^9.

Использование дрозофилы в качестве модельной системы позволило разработать необходимые инструменты для изучения гетерохроматина без использования электронной микроскопии^10. С момента описания изменения эффекта положения и открытия гетерохроматин-ассоциированных белков, таких как HP1a, и постпереводных модификаций гистона многие группы разработали несколько иммуногистохимических методов, которые позволяют визуализировать эти гетерохроматические^{области 10,11.}

Эти методы основаны на использовании специфических антител, которые распознают гетерохроматин-ассоциированные белки или гистоновые метки. Для каждого типа клеток и антител условия фиксации и пермеабилизации должны быть определены эмпирически. Кроме того, условия могут варьироваться, если используются дополнительные механические процессы, такие как методы раздавливания. В этом протоколе мы описываем использование слюнных желез Drosophila для изучения гетерохроматических очагов. Слюнные железы имеют политенизированные клетки, которые содержат более 1000 копий генома, что обеспечивает усиленное представление о большинстве особенностей хроматина, за исключением спутниковой ДНК и некоторых гетерохроматических областей, которые недостаточно реплицируются. Тем не менее, области гетерохроматина легко визуализируются в препаратах политеновых хромосом, но методы раздавливания могут иногда нарушать характерные хроматин-связанные комплексы или архитектуру хроматина. Поэтому иммунолокализация белков в целой ткани слюнных желез может превзойти эти нежелательные эффекты. Мы использовали этот протокол для обнаружения нескольких связанных с хроматином белков, и мы продемонстрировали, что этот протокол в сочетании с мутантными запасами дрозофилы может быть использован для изучения нарушения гетерохроматина^12.

Protocol

1. Третья культура личинок Приготовить 1 л стандартной среды, добавив 100 г дрожжей, 100 г нерафинированного цельного тростникового сахара, 16 г агара, 10 мл пропионовой кислоты и 14 г желатина. Растворите все ингредиенты, кроме дрожжей, в 800 мл водопроводной воды, а затем растворите дрожжи….

Representative Results

Репрезентативные результаты иммуноокрашивания HP1a в слюнных железах Drosophila показаны на рисунке 1. Положительным результатом является наблюдение одной фокусной точки(рисунок 1а)(гетерохроматический агрегат или конденсат). Отрицательным результатом …

Discussion

Клеточная функция эукариотических организмов может определять 3D-структуру внутри ядра, которая поддерживается взаимодействиями между различными белками с хроматином и различными молекулами, включая РНК. В последние три года биологические конденсаты, которые имели отношение, в том ч?…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	brand not critical
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22×22, brand not critical
DTT	Sigma	d9779	brand not critical
EDTA	Sigma	E5134	brand not critical
EGTA			brand not critical
Glass slide	Gold seal	3011	brand not critical
H3BO3	Baker	0084-01	brand not critical
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	brand not critical
Methanol	Baker	9070-03	brand not critical
NaCl	Sigma	71376	brand not critical
NaOH			brand not critical
PIPES			brand not critical
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	brand not critical
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, brand not critical