يهدف هذا البروتوكول إلى تصور مجاميع الهتيروماتين في خلايا البوليتين Drosophila.
يمكن أن يكون تصور مجاميع الهتيروماتين عن طريق التصبغ المناعي أمرا صعبا. يتم الحفاظ على العديد من مكونات الثدييات من الكروماتين في Drosophila melanogaster. لذلك، وهو نموذج ممتاز لدراسة تشكيل heterochromatin والصيانة. الخلايا المتعددة، مثل تلك الموجودة في الغدد اللعابية من يرقات نجمة النستار الثالثة D. melanogaster، توفر أداة ممتازة لمراقبة الكروماتين تضخيم ما يقرب من ألف مرة، وسمحت للباحثين لدراسة التغيرات في توزيع التركروماتين في النواة. على الرغم من أن مراقبة مكونات هيتيركروماتين يمكن أن تتم مباشرة في مستحضرات كروموسوم البوليتين ، يمكن تغيير توطين بعض البروتينات من خلال شدة العلاج. لذلك ، فإن التصور المباشر للتركروماتين في الخلايا يكمل هذا النوع من الدراسة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف تقنيات التصبغ المناعي المستخدمة لهذا النسيج، واستخدام الأجسام المضادة الفلورية الثانوية، والمجهر البؤري لمراقبة هذه المجاميع الهتيروماتين بمزيد من الدقة والتفاصيل.
منذ الدراسات المبكرة لإميل هيتز1، يعتبر هيتيركروماتين منظما مهما للعمليات الخلوية مثل التعبير الجيني ، والفصل الميوتي والميتوتيك للكروموسومات ، والحفاظ على استقرار الجينوم2و3و4.
وينقسم الهتيروماتين أساسا إلى نوعين: هيتيركروماتين التأسيسية التي تحدد بشكل مميز تسلسل المتكررة، والعناصر القابلة للانتقال التي توجد في مواقع كروموسوم محددة مثل التيلوميرات والقنطورات. هذا النوع من heterochromatin هو تعريف أساسا اللاجينية من قبل علامات الهستون محددة مثل دي أو ثلاثي ميثيل ليسين 9 من الهستون H3 (H3K9me3) وربط بروتين هيتيروكروماتين 1a (HP1a)5,6. من ناحية أخرى، لغات heterochromatin الكلية من خلال ذراعي الكروموسوم ويتكون أساسا من الجينات صامتة تنمويا7،8. وقد كشف عن التئاس المناعة من كتل heterochromatin في خلايا ميتافيزي، أو مراقبة المجاميع heterochromatin في الخلايا بين المراحل، الكثير من الضوء في فهم تشكيل ووظيفة المناطق غير لوني9.
وقد سمح استخدام Drosophila كنظام نموذجي لتطوير الأدوات الأساسية لدراسة الهتيروماتين دون استخدام المجهر الإلكتروني10. منذ وصف تأثير الموقف المتنوع واكتشاف البروتينات المرتبطة بالهيتوكروماتين ، مثل HP1a ، وتعديلات ما بعد الهستون بعد الترجمية ، طورت العديد من المجموعات العديد من التقنيات الكيميائية المناعية التي تسمح بتصور هذه المناطق غير اللونية10،11.
وتستند هذه التقنيات على استخدام أجسام مضادة محددة تتعرف على البروتينات المرتبطة بالهتيروماتين أو علامات الهستون. لكل نوع الخلية والأجسام المضادة، يجب تحديد شروط التثبيت والتهيئة تجريبيا. أيضا، قد تختلف الظروف إذا تم استخدام عمليات ميكانيكية إضافية مثل تقنيات السحق. في هذا البروتوكول، ونحن نصف استخدام الغدد اللعابية Drosophila لدراسة بؤر غير لونية. الغدد اللعابية لديها خلايا متعددة الأضلاع تحتوي على أكثر من 1000 نسخة من الجينوم ، مما يوفر رؤية مكبرة لمعظم ميزات الكروماتين ، باستثناء الحمض النووي للأقمار الصناعية وبعض المناطق غير اللونية التي تخضع للتكفير. ومع ذلك ، يتم تصور مناطق heterochromatin بسهولة في مستحضرات كروموسوم البوليتين ، ولكن تقنيات السحق قد تعطل في بعض الأحيان المجمعات المميزة المرتبطة بالكروماتين أو بنية الكروماتين. لذلك ، يمكن أن يتجاوز تحديد موقع المناعة للبروتينات في أنسجة الغدة اللعابية الكاملة هذه الآثار غير المرغوب فيها. لقد استخدمنا هذا البروتوكول للكشف عن العديد من البروتينات المقيدة بالكروماتين ، وأثبتنا أن هذا البروتوكول جنبا إلى جنب مع مخزونات Drosophila المتحولة يمكن استخدامه لدراسة اضطراب الهتيروماتين12.
يمكن للوظيفة الخلوية للكائنات الحية النواة تحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد داخل النواة ، والذي تدعمه التفاعلات بين البروتينات المختلفة مع الكروماتين والجزيئات المختلفة بما في ذلك الحمض النووي الريبي. في السنوات الثلاث الماضية، والمكثفات البيولوجية التي لها أهمية، بما في ذلك هيتيركروماتين،…
The authors have nothing to disclose.
نشكر ماركو أنطونيو روزاليس فيغا وهابيل سيغورا على التقاط بعض الصور الكونفوكوكال، وكارمن مونيوز لإعداد وسائل الإعلام، والدكتور أرتورو بيمنتل، .C أندريس ساراليغوي، والدكتور كريس وود من LMNA للحصول على المشورة بشأن استخدام المجاهر.
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
EGTA | brand not critical | ||
Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
NaOH | brand not critical | ||
PIPES | brand not critical | ||
Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |