このプロトコルは、D2O代謝の単一細胞刺激ラマン散乱イメージングによる2.5時間以内の迅速な抗菌剤感受性試験(AST)アッセイを提示します。この方法は、尿または全血環境の細菌に適用され、診療所での迅速な単一細胞表現型ASTに変化します。
薬剤耐性感染症の拡大を遅らせ、防止するために、病原体に対する抗菌効果を定量的に決定するための迅速な抗菌薬感受性試験(AST)が緊急に必要です。通常、長時間の培養に基づく従来の方法でASTを完了するには数日かかり、臨床サンプルでは直接機能しません。ここでは、酸化重水素(D2O)代謝取り込みの誘導ラマン散乱(SRS)イメージングによって可能になる迅速なAST法について報告する。バイオマスへのD2Oの代謝取り込みおよび単一細菌レベルでの抗生物質への曝露時の代謝活性阻害は、SRSイメージングによってモニターされる。抗生物質への曝露時の細菌の単一細胞代謝不活化濃度(SC-MIC)は、合計2.5時間のサンプル調製および検出後に得ることができます。さらに、この迅速なAST法は、尿や全血などの複雑な生物学的環境の細菌サンプルに直接適用できます。重水素取り込みのSRS代謝イメージングは、臨床における迅速な単一細胞表現型ASTに変革的です。
薬剤耐性(AMR)は、感染症の効果的な治療に対する世界的な脅威として増大しています1。AMRは、抗生物質耐性菌との闘いのための対策を講じなければ、2050年までに年間1,000万人が死亡し、世界のGDPが100兆ドル減少すると予測されています1,2。これは、抗生物質耐性菌の出現を遅らせ、関連する死亡率を低下させるために、感染性細菌の抗生物質感受性試験(AST)のための迅速かつ革新的な診断方法の緊急の必要性を強調しています3。可能な限り最良の臨床転帰を確実にするためには、24時間以内に効果的な治療法を導入することが重要です。ただし、ディスク拡散法やブロス希釈法などの現在のゴールドスタンダード法では、通常、臨床サンプルのプレインキュベーション手順に少なくとも24時間、最小阻害濃度(MIC)結果を得るにはさらに16〜24時間かかります。全体として、これらの方法は時間がかかりすぎて、診療所での感染症治療の即時決定を導くことができず、抗菌薬耐性の出現と拡大につながります4。
迅速な検出のために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)ベースの技術5などの遺伝子型AST法が開発されています。このような技術は、迅速なAST結果を提供するために、特異的耐性遺伝子配列を測定する。それらは時間のかかる細胞培養に依存しません。ただし、耐性のある特定の既知の遺伝子配列のみがテストされます。したがって、その適用は、さまざまな細菌種またはさまざまな耐性メカニズムに限定されています。また、治療決定のためのMIC結果を提供することはできません6,7。さらに、これらの制限を克服するために、迅速なASTのための新しい表現型法が開発中であり、マイクロ流体デバイス9、10、11、12、13、光学デバイス14、15、16、核酸コピー数17、18、およびラマン分光法19を含む表現型ASTが含まれ、20、21、22、23、24。これらの方法はAST結果を導く時間を短縮しますが、それらのほとんどは細菌分離株にのみ適用でき、臨床検体に直接適用できず、それでも長時間のプレインキュベーションが必要です。
本研究では、SRSイメージングによる細胞代謝活性のモニタリングにより、尿中および全血中の細菌の感受性を迅速に決定する方法を提示します。水(H2O)は、生細胞における必須の生体分子合成プロセスの大部分に関与しています。水の同位体として、NADPHの酸化還元活性水素原子とD2OのD原子との間の酵素触媒H/D交換反応により、重水素を細胞内のバイオマスに取り込むことができる25,26。重水素化脂肪酸合成反応は、重水素標識NADPHによって媒介される。アミノ酸(AAs)の反応へのD2Oの取り込みは、重水素化タンパク質産生をもたらす26(図1)。このようにして、単一の微生物細胞内で新たに合成されたC−D結合含有生体分子は、検出される一般的な代謝活性マーカーとして採用することができる。de novo合成C-D結合を読み取るために、生体分子の特異的で定量的な化学情報を提供する汎用性の高い分析ツールであるラマン分光法は、抗菌剤感受性を決定し、テスト時間を数時間に大幅に短縮するために広く使用されています27,28,29,30.しかしながら、ラマン散乱プロセスの本質的に低い効率のために、自発ラマン分光法は低い検出感度を有する。そのため、自発ラマン分光法を用いてリアルタイムの画像結果を得ることは困難です。コヒーレント反ストークスラマン散乱(CARS)や誘導ラマン散乱(SRS)を含むコヒーレントラマン散乱(CRS)は、自発ラマン分光法よりも桁違いに大きな大きさを生成するコヒーレント光場により、高い検出感度に達し、単一細胞レベルで高速、特異的、定量的な化学イメージングを実現します31,32,33,34,35、36,37,38,39。
ここでは、我々の最新の研究40に基づいて、単一細胞レベルでの正常培地、尿、および全血環境における細菌のD2O取り込みのフェムト秒SRS C−Dイメージングによる代謝活性および抗菌感受性の迅速な決定のためのプロトコルを提示する。フェムト秒SRSイメージングは、2.5時間以内の単一細菌レベルでの抗生物質に対する単一細胞代謝不活化濃度(SC-MIC)のモニタリングを容易にします。SC-MICの結果は、ブロス微量希釈による標準的なMICテストによって検証されます。私たちの方法は、細菌尿路感染症(UTI)および血流感染(BSI)病原体の抗菌薬感受性を決定するために適用可能であり、従来の方法と比較してアッセイ時間が大幅に短縮され、単一細胞レベルでの臨床での迅速な表現型ASTの機会を開きます。
迅速なASTは、サンプルからSC-MIC結果までの2.5時間以内のシングルセルSRS代謝イメージングを使用して、抗生物質治療に対する細菌代謝活性の応答を評価することによって得ることができます。細菌の代謝活性および抗菌感受性の応答は、C−D結合のSRSイメージングを用いて生体分子合成のためのD2Oの代謝取り込みをモニターすることによって検出することができる。水は生細胞に遍在…
The authors have nothing to disclose.
この作業は、NIH R01AI141439からJ.-X.CおよびM.S、およびR35GM136223からJ.-X.C.のサポートを受けました。
Acousto-optic modulation | Gooch&Housego | R15180-1.06-LTD | Modulating stokes laser beam |
Amoxicillin | Sigma Aldrich | A8523-5G | |
Bandpass filter | Chroma | HQ825/150m | Block the stokes laser beam before the photodiode |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016-100G | Cation adjustment |
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth | Fisher Scientific | B12322 | Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75002542 | |
Cover Glasses | VWR | 16004-318 | |
Culture tube with snap cap | Fisher brand | 149569B | |
Daptomycin | Acros | A0386346 | |
Deuterium oxide | 151882 | Organic solvent to dissolve antibiotics | |
Deuterium oxide-d6 | Sigma Aldrich | 156914 | Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system |
Escherichia coli BW 25113 | The Coli Genetic Stock Center | 7636 | |
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher brand | 05-408-129 | |
Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G4918 | |
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters | Millipore-Sigma | SLSV025NB | pore size 5 µm |
ImageJ software | NIH | Version: 2.0.0-rc-69/1.52t | Image processing and analysis |
Incubating orbital shaker set at 37 °C | VWR | 97009-890 | |
Inoculation loop | Sigma | BR452201-1000EA | |
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | Model: insight X3 | Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging |
Lock-in amplifier | Zurich Instrument | HF2LI | Demodulate the SRS signals |
Oil condenser | Olympus | U-AAC | NA 1.4 |
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) | American Type Culture Collection | ATCC 47085 | |
Photodiode | Hamamatsu | S3994-01 | Detector |
Polypropylene conical tube 15 mL | Falcon | 14-959-53A | |
Polypropylene filters | Thermo Scientific | 726-2520 | pore size 0.2 µm |
Sterile petri dishes | Corning | 07-202-031 | |
Syringe 10 mL | Fisher brand | 14955459 | |
UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU 530 | Measuring optical density at wavelength of 600 nm |
Vortex mixer | VWR | 97043-562 | |
Water objective | Olympus | UPLANAPO/IR | 60×, NA 1.2 |