يقدم هذا البروتوكول اختبار الحساسية السريع لمضادات الميكروبات (AST) في غضون 2.5 ساعة عن طريق تصوير تشتت رامان المحفز بخلية واحدة لعملية التمثيل الغذائي D2O. تنطبق هذه الطريقة على البكتيريا الموجودة في البول أو بيئة الدم الكاملة ، والتي تعد تحويلية للنمط الظاهري السريع أحادي الخلية AST في العيادة.
لإبطاء ومنع انتشار العدوى المقاومة لمضادات الميكروبات ، هناك حاجة ماسة إلى اختبار الحساسية السريع لمضادات الميكروبات (AST) لتحديد التأثيرات المضادة للميكروبات على مسببات الأمراض كميا. عادة ما يستغرق الأمر أياما لإكمال AST بالطرق التقليدية القائمة على الثقافة طويلة الأمد ، ولا تعمل مباشرة للعينات السريرية. هنا ، نبلغ عن طريقة AST سريعة تم تمكينها عن طريق التصوير المحفز لتشتت رامان (SRS) لدمج التمثيل الغذائي لأكسيد الديوتيريوم (D2O). تتم مراقبة الدمج الأيضي ل D2O في الكتلة الحيوية وتثبيط النشاط الأيضي عند التعرض للمضادات الحيوية على مستوى البكتيريا المفردة بواسطة تصوير SRS. يمكن الحصول على تركيز تعطيل التمثيل الغذائي أحادي الخلية (SC-MIC) للبكتيريا عند التعرض للمضادات الحيوية بعد ما مجموعه 2.5 ساعة من تحضير العينة واكتشافها. علاوة على ذلك ، فإن طريقة AST السريعة هذه قابلة للتطبيق مباشرة على العينات البكتيرية في البيئات البيولوجية المعقدة ، مثل البول أو الدم الكامل. يعد التصوير الأيضي SRS لدمج الديوتيريوم تحويليا للنمط الظاهري السريع أحادي الخلية AST في العيادة.
تشكل مقاومة مضادات الميكروبات تهديدا عالميا متزايدا للعلاج الفعال للأمراض المعدية1. من المتوقع أن تتسبب مقاومة مضادات الميكروبات في 10 ملايين حالة وفاة إضافية سنويا وخسارة 100 تريليون دولار في الناتج المحلي الإجمالي العالمي بحلول عام 2050 إذا لم يتم اتخاذ أي إجراء لمكافحة البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية 1,2. وهذا يؤكد الحاجة الملحة لطرق تشخيص سريعة ومبتكرة لاختبار حساسية البكتيريا المعدية للمضادات الحيوية (AST) لإبطاء ظهور البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية وتقليل معدل الوفيات ذات الصلة3. لضمان أفضل نتيجة سريرية ممكنة ، من الضروري إدخال علاج فعال في غضون 24 ساعة. ومع ذلك ، فإن الطريقة القياسية الذهبية الحالية ، مثل طريقة نشر القرص أو طريقة تخفيف المرق ، تتطلب عادة 24 ساعة على الأقل لإجراء الحضانة المسبقة للعينات السريرية و 16-24 ساعة إضافية للحصول على الحد الأدنى من نتائج التركيز المثبط (MIC). بشكل عام ، تستغرق هذه الطرق وقتا طويلا للغاية بحيث لا يمكن توجيه قرار فوري لعلاج الأمراض المعدية في العيادة ، مما يؤدي إلى ظهور وانتشار مقاومة مضادات الميكروبات4.
تم تطوير طرق AST للنمط الجيني ، مثل التقنيات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)5 ، للكشف السريع. تقيس هذه التقنيات التسلسلات الجينية للمقاومة المحددة من أجل توفير نتائج AST سريعة. أنها لا تعتمد على ثقافة الخلايا التي تستغرق وقتا طويلا. ومع ذلك ، يتم اختبار التسلسلات الجينية المعروفة فقط مع المقاومة. لذلك ، يقتصر تطبيقه على الأنواع البكتيرية المختلفة أو آليات المقاومة المختلفة. أيضا ، لا يمكنهم تقديم نتائج MIC لقرارات العلاج 6,7. إلى جانب ذلك ، يتم تطوير طرق النمط الظاهري الجديدة ل AST السريع للتغلب على هذه القيود8 ، بما في ذلك أجهزة الموائع الدقيقة9،10،11،12،13 ، والأجهزة البصرية 14،15،16 ، AST المظهري الذي يحدد كمية نسخة الأحماض النوويةرقم 17،18 ، وطرق رامان الطيفية 19 ، 20،21،22،23،24. تقلل هذه الطرق من الوقت اللازم لتوجيه نتائج AST ، ومع ذلك ، فإن معظمها ينطبق فقط على العزلات البكتيرية ، وليس مباشرة على العينات السريرية ، ولا يزال يتطلب حضانة طويلة الأمد.
في هذا العمل ، نقدم طريقة لتحديد سريع لحساسية البكتيريا في البول والدم الكامل من خلال مراقبة النشاط الأيضي الخلوي عن طريق التصوير SRS. يشارك الماء (H2O) في الغالبية العظمى من عمليات التوليف الجزيئي الحيوي الأساسية في الخلايا الحية. كإيزوتوبولوج للماء ، من خلال تفاعل التبادل H / D المحفز بالإنزيم بين ذرة الهيدروجين النشطة للأكسدة والاختزال في NADPH والذرة D في D2O ، يمكن دمج الديوتيريوم في الكتلة الحيوية داخل الخلية25,26. يتم التوسط في تفاعل تخليق الأحماض الدهنية المديوتيريوم المسمى NADPH. ينتج عن دمج D2O في تفاعلات الأحماض الأمينية (AAs) إنتاج البروتين المثبط26 (الشكل 1). وبهذه الطريقة ، يمكن استخدام الجزيئات الحيوية المحتوية على رابطة C-D المركبة حديثا في الخلايا الميكروبية المفردة كعلامة عامة للنشاط الأيضي ليتم اكتشافها. لقراءة روابط C-D المركبة من جديد ، يستخدم التحليل الطيفي Raman ، وهو أداة تحليلية متعددة الاستخدامات توفر معلومات كيميائية محددة وكمية للجزيئات الحيوية ، على نطاق واسع لتحديد الحساسية لمضادات الميكروبات وتقليل وقت الاختبار بشكل كبير إلى بضع ساعات27،28،29،30 . ومع ذلك ، نظرا للكفاءة المنخفضة المتأصلة في عملية تشتت رامان ، فإن التحليل الطيفي التلقائي لرامان ذو حساسية كشف منخفضة. لذلك ، من الصعب الحصول على نتائج الصور في الوقت الفعلي باستخدام التحليل الطيفي التلقائي لرامان. وصل تشتت رامان المتماسك (CRS) ، بما في ذلك تشتت رامان المتماسك المضاد لستوكس (CARS) وتشتت رامان المحفز (SRS) ، إلى حساسية عالية للكشف بسبب مجال الضوء المتماسك لتوليد أوامر بحجم أكبر من مطيافية رامان التلقائية ، وبالتالي تقديم تصوير كيميائي عالي السرعة ومحدد وكمي على مستوى الخلية الواحدة31،32،33،34،35 ، 36،37،38،39.
هنا ، بناء على أحدث أعمالنا40 ، نقدم بروتوكولا للتحديد السريع للنشاط الأيضي والحساسية لمضادات الميكروبات عن طريق تصوير الفيمتو ثانية SRS C-D لدمج D2O للبكتيريا في الوسط الطبيعي والبول وبيئة الدم الكاملة على مستوى الخلية الواحدة. يسهل تصوير الفيمتو ثانية SRS مراقبة تركيز تعطيل التمثيل الغذائي للخلية الواحدة (SC-MIC) ضد المضادات الحيوية على مستوى البكتيريا المفردة في غضون 2.5 ساعة. يتم التحقق من صحة نتائج SC-MIC عن طريق اختبار MIC القياسي عن طريق التخفيف الدقيق للمرق. طريقتنا قابلة للتطبيق لتحديد حساسية مضادات الميكروبات للبكتيريا عدوى المسالك البولية (UTI) ومسببات عدوى مجرى الدم (BSI) مع وقت فحص أقل بكثير مقارنة بالطريقة التقليدية ، مما يفتح الفرصة ل AST النمط الظاهري السريع في العيادة على مستوى الخلية الواحدة.
يمكن الحصول على AST السريع من خلال تقييم استجابة النشاط الأيضي البكتيري للعلاج بالمضادات الحيوية باستخدام التصوير الأيضي SRS أحادي الخلية في غضون 2.5 ساعة من العينة إلى نتائج SC-MIC. يمكن الكشف عن استجابة النشاط الأيضي البكتيري والحساسية لمضادات الميكروبات من خلال مراقبة الدمج الأيضي ل D2O…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل NIH R01AI141439 إلى J.-X.C و MS ، و R35GM136223 إلى J.-X.C.
Acousto-optic modulation | Gooch&Housego | R15180-1.06-LTD | Modulating stokes laser beam |
Amoxicillin | Sigma Aldrich | A8523-5G | |
Bandpass filter | Chroma | HQ825/150m | Block the stokes laser beam before the photodiode |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C1016-100G | Cation adjustment |
Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth | Fisher Scientific | B12322 | Antimicrobial susceptibility testing of microorganisms by broth dilution methods |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75002542 | |
Cover Glasses | VWR | 16004-318 | |
Culture tube with snap cap | Fisher brand | 149569B | |
Daptomycin | Acros | A0386346 | |
Deuterium oxide | 151882 | Organic solvent to dissolve antibiotics | |
Deuterium oxide-d6 | Sigma Aldrich | 156914 | Organic solvent as a standard to calibrate SRS imaging system |
Escherichia coli BW 25113 | The Coli Genetic Stock Center | 7636 | |
Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | Fisher brand | 05-408-129 | |
Gentamicin sulfate | Sigma Aldrich | G4918 | |
Hydrophilic Polyvinylidene Fluoride filters | Millipore-Sigma | SLSV025NB | pore size 5 µm |
ImageJ software | NIH | Version: 2.0.0-rc-69/1.52t | Image processing and analysis |
Incubating orbital shaker set at 37 °C | VWR | 97009-890 | |
Inoculation loop | Sigma | BR452201-1000EA | |
InSight DeepSee femtosecond pulsed laser | Spectra-Physics | Model: insight X3 | Tunable laser source and fixed laser source at 1045 nm for SRS imaging |
Lock-in amplifier | Zurich Instrument | HF2LI | Demodulate the SRS signals |
Oil condenser | Olympus | U-AAC | NA 1.4 |
Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1) | American Type Culture Collection | ATCC 47085 | |
Photodiode | Hamamatsu | S3994-01 | Detector |
Polypropylene conical tube 15 mL | Falcon | 14-959-53A | |
Polypropylene filters | Thermo Scientific | 726-2520 | pore size 0.2 µm |
Sterile petri dishes | Corning | 07-202-031 | |
Syringe 10 mL | Fisher brand | 14955459 | |
UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | Model: DU 530 | Measuring optical density at wavelength of 600 nm |
Vortex mixer | VWR | 97043-562 | |
Water objective | Olympus | UPLANAPO/IR | 60×, NA 1.2 |