Hızlı ve Nicel Intravital Chick Chorioallantoic Membran Modeli Kullanılarak Metastatik Regülatörlerin Keşfi
Summary
Bu, kanser metastazının baskılayıcılarını veya sürücülerini taramak için etkili bir yöntemdir. Bir ifade kütüphanesi ile transdüklenen hücreler, metastatik koloniler oluşturmak için tavuk chorioallantoic membran vaskülatürüne enjekte edilir. İnvazivliği azalmış veya artmış koloniler, fenotiplerini doğrulamak için ekscised, genişletilmiş, reenjected ve son olarak, yüksek verim sıralaması kullanılarak analiz edilir.
Abstract
Kanser araştırmalarındaki son gelişmeler, kanser metastazının son derece karmaşık doğasını göstermektedir. Birden fazla gen veya gen ağının, kanser tipine, dokusuna ve bireysel hasta özelliklerine bağlı olarak kanser metastatik basamaklı genlerini ve gen ürünlerini farklı bir şekilde düzenlemede rol aldığı bulunmuştur. Bunlar genetik terapötikler ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için potansiyel olarak önemli hedefleri temsil eder. Bu genetik hedeflerin belirlenmesi için hızlı tarama platformlarının geliştirilmesi şarttır.
Civciv chorioallantoic membran (CAM), yumurta kabuğunun altında bulunan ve gelişmekte olan embriyoda gaz değişimine izin veren son derece damarlı, kollajen bakımından zengin bir zardır. CAM’ın konumu ve damarlanması nedeniyle, kollajen zengin matrisi ve vaskülat ile kanser hücresi etkileşimlerinin sağlam insan kanseri hücre ksinograftingini ve gerçek zamanlı görüntülenmesini sağlayan intravital bir insan kanseri metastaz modeli olarak geliştirdik.
Bu model kullanılarak, kanser metastazının yeni sürücülerinin veya baskılayıcılarının tanımlanması için nicel bir tarama platformu tasarlanmıştır. Tam bir insan genom shRNA gen kütüphanesine sahip bir baş ve boyun HEp3 kanser hücresi havuzu dönüştürdük, sonra hücreleri düşük yoğunlukta CAM vaskülatına enjekte ettik. Hücreler çoğaldı ve tek tümörlü hücre kolonileri oluşturdu. CAM dokusuna istila edemeyen bireysel koloniler kompakt bir koloni fenotipi olarak görülebilir ve hücrelerde bulunan transdüklenmiş shRNA’nın tanımlanması için eksilirdi. Bireysel kolonilerin görüntüleri istilacı oldukları için değerlendirildi. Yanlış pozitiflerin oranını azaltmak için birden fazla seçim turu gerçekleştirildi. Bireysel, izole kanser hücre klonları veya ilgi genlerini ifade eden yeni tasarlanmış klonlar primer tümör oluşumu testine veya kanser hücresi vaskülat ko-seçenek analizine tabi tutuldu. Özetle, metastatik karşıtı hedef tanımlamasına ve dinamik ve karmaşık bir olay basamaklanmasının intravital analizine olanak tanıyan hızlı bir tarama platformu sunuyoruz.
Introduction
Metastaz, kanser hastasının ölümünün ana nedenidir1,2,3. Metastatik kanser hücreleri, metastatik basamaklamanın beş adımı boyunca kanser türüne bağlı olarak farklı sinyal yolları kullanır: yerel istila, intravazasyon, dolaşımda sağkalım, ekstravazasyon ve uzak metastatik bölgelerde koloni genişlemesi. Bu metastatik sürecin mevcut anlayışı, iki darboğaz adımı olduğunu, birinin birincil tümörden kanser hücresinin yönlü istilası olduğunu ve ikincisi uzak bölge metastatik lezyonunun kurulması olduğunu göstermektedir4,5,6. Her iki adım da kanser hücrelerinin ilk istila veya uzak metastatik lezyon oluşumu bölgelerinde kollajen ve vaskülat ile aktif olarak etkileşime girmesini gerektirir. Bu nedenle, metastatik kanser hücreleri hücrelere bağlanabilmeli, kollajen liflerini yeniden şekillendirebilmeli ve damar duvarları boyunca yönlü istila edebilmelidir7. Kanser hücrelerinin bu adımları tamamlamasını engellemek için antimetastatik terapötik hedefleri hızla belirleyebilen tarama modelleri en yüksek öneme sahiptir. Mevcut in vitro tarama modelleri karmaşık canlı doku ortamını tam olarak taklit etmez. Fare modelleri maliyetli ve zaman alıcıdır. Bu nedenle, karmaşık canlı doku ortamları ve hedeflerin hızlı tanımlanmasını sağlayan intravital tarama platformlarına acil ihtiyaç vardır.
Son on yıl içinde, tavuk embriyosu insan kanseri metastazının sağlam ve uygun maliyetli bir modeli olarak kurulmuştur 8,9,10,11,12. Chick chorioallantoic membran (CAM) dokusu ince ve yarı saydamdır, bu da primer tümör ve/veya metastatik bölgelerde hücre ve koloni davranışlarının intravital mikroskobik görüntülenmesi için idealdir12. Birden fazla insan kanser hücre hattından primer tümör büyümesi, CAM dokusuna mikroenjeksiyondan sadece birkaç gün sonra başlatılabilir ve metastaz yapılabilir. Kanser hücreleri CAM dokusuna intravenöz, intra-CAM veya kollajen onplantlar da dahil olmak üzere çeşitli şekillerde uygulanabilir, bu esneklik araştırmacının kanser ilerlemesinin belirli aşamalarına, örneğin metastatik lezyon oluşumuna, primer tümörden invazyona veya anjiogeneze odaklanmasını sağlar.
Burada, kanser hücrelerinin invaziv metastatik lezyonlar oluşturma yeteneğini ölçmek için kullanılabilecek nicel bir tarama platformunu açıklıyoruz. Bir ifade kütüphanesi ile transdüklenmiş kanser hücreleri, düşük yoğunlukta CAM vaskülat içine intravenöz olarak enjekte edilir. Metastatik koloniler 4-5 gün boyunca oluşur, daha sonra ortaya çıkan kolonilerin istila kapasitesi ve vaskülat etkileşimi değerlendirilir. İstilacı olamayan bireysel koloniler eksize edilir, yayılır ve fenotipleri, koloni kompaktlığı ve kanser hücre-kan damarı temaslarının reenjeksiyonu ve niceliği ile CAM’de doğrulanır. Tek metastatik koloni mutant fenotipinden sorumlu ifade kütüphanesi yapıları, yüksek verim sıralaması yoluyla izole edilmiş koloni genomik DNA’sından tanımlanır. Aynı platform, bir gen ile gözlenen fenotip arasındaki nedensel bağlantıyı doğrulamak veya gözlemlenen fenotip üzerinde derinlemesine mekanistik çalışmalar yapmak için daha fazla kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada genetik veya ilaç adayı ekranlar gibi önemli uygulamalar için kullanılabilecek hızlı bir floresan mikroskopi tabanlı intravital tarama protokolünü açıklıyoruz. Genetik bir ilgi kütüphanesi ile transdüklenmiş veya bireysel ifade yapıları ile transklüzyona yakalanmış kanser hücreleri, bu civciv CAM modeli kullanılarak ilgi fenotipi olarak hızla taranabilir ve ölçülebilir. Transdüksiyon veya transfection protokolleri kitaplık türüne bağlı olarak önemli ölçüde değiştiğinden, bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü Grant #702849 tarafından JDL ve KS’ye desteklenmiştir. Dr. Lewis, Alberta Kanser Vakfı tarafından desteklenen Prostat Kanseri Araştırmalarında Frank ve Carla Sojonky Kürsüsü’ne sahiptir.
Materials
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van’t Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D., Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. . The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. , 27-37 (2016).
