Это эффективный метод скрининга супрессоров или драйверов метастазирования рака. Клетки, трансдуцированные с помощью библиотеки экспрессии, вводятся в сосудистую сеть хориоаллантоической мембраны курицы с образованием метастатических колоний. Колонии, имеющие пониженную или повышенную инвазивность, иссекаются, расширяются, повторно встраиваются для подтверждения их фенотипа и, наконец, анализируются с использованием высокопроизводительного секвенирования.
Последние достижения в исследованиях рака проиллюстрировали очень сложную природу метастазирования рака. Было обнаружено, что несколько генов или генных сетей участвуют в дифференциальной регуляции генов метастатического каскада рака и генных продуктов в зависимости от типа рака, ткани и индивидуальных характеристик пациента. Они представляют собой потенциально важные цели для генетической терапии и персонализированной медицины. Разработка платформ быстрого скрининга имеет важное значение для идентификации этих генетических мишеней.
Хориоаллантоическая мембрана цыпленка (CAM) представляет собой высоко васкуляризированную, богатую коллагеном мембрану, расположенную под яичной скорлупой, которая обеспечивает газообмен в развивающемся эмбрионе. Из-за расположения и васкуляризации CAM мы разработали его как модель метастазирования рака человека прижизной, которая позволяет надежно проводить ксенотрансплантирование раковых клеток человека и визуализацию в режиме реального времени взаимодействий раковых клеток с богатой коллагеном матрицей и сосудистой системой.
Используя эту модель, была разработана платформа количественного скрининга для идентификации новых драйверов или супрессоров метастазирования рака. Мы трансдуцировали пул раковых клеток HEp3 головы и шеи с полной библиотекой генов шРНК генома человека, а затем вводили клетки с низкой плотностью в сосудистую азкулятуру CAM. Клетки размножались и образовывали одноопухолевые клеточные колонии. Отдельные колонии, которые не могли вторгнуться в ткань CAM, были видны как компактный колониальный фенотип и иссякались для идентификации трансдуцированной шРНК, присутствующей в клетках. Изображения отдельных колоний оценивали на их инвазивность. Было проведено несколько раундов отбора, чтобы уменьшить частоту ложных срабатываний. Отдельные, изолированные клоны раковых клеток или недавно спроектированные клоны, которые экспрессируют гены, представляющие интерес, были подвергнуты первичному анализу опухолевого образования или анализу кооптации сосудистой основе раковых клеток. Таким образом, мы представляем платформу быстрого скрининга, которая позволяет идентифицировать антиметастатическую мишень и прижизальный анализ динамического и сложного каскада событий.
Метастазы являются основной причиной смерти онкологического больного1,2,3. Метастатические раковые клетки используют различные сигнальные пути, зависящие от типа рака, на протяжении пяти этапов метастатического каскада: локальная инвазия, интравазация, выживаемость в кровообращении, экстравазация и расширение колонии в отдаленных метастатических местах. Современное понимание этого метастатического процесса предполагает, что существует два узких места, один из них – направленная инвазия раковой клетки из первичной опухоли, а вторая – установление отдаленного участка метастатического поражения4,5,6. Оба этапа требуют, чтобы раковые клетки активно взаимодействовали с коллагеном и сосудистой клеткой в местах первоначальной инвазии или образования отдаленного метастатического поражения. Поэтому метастатические раковые клетки должны быть способны прикрепляться к клеткам, ремоделировать коллагеновые волокна и направленно вторгаться вдоль сосудистых стенок7. Скрининговые модели, которые могут быстро идентифицировать антиметастатические терапевтические мишени для блокирования раковых клеток от завершения этих шагов, имеют первостепенное значение. Существующие модели скрининга in vitro не полностью имитируют сложную среду живых тканей. Мышиные модели являются дорогостоящими и трудоемкими. Поэтому существует острая необходимость в платформах для скрининга прижизностных сред, которые обеспечивают сложную среду живой ткани и быструю идентификацию целей.
В течение последнего десятилетия куриный эмбрион был создан как надежная и экономически эффективная модель метастазирования рака человека8,9,10,11,12. Ткань хориоаллантоической мембраны (CAM) цыпленка является тонкой и полупрозрачной, что делает ее идеальной для прижизненных микроскопических изображений поведения клеток и колоний в первичных опухолевых и/или метастатических участках12. Первичный рост опухоли из нескольких линий раковых клеток человека может быть инициирован и метастазирован в течение всего нескольких дней после микроинъекции в ткань CAM. Раковые клетки могут быть введены в ткань CAM несколькими способами, включая внутривенно, внутри CAM или в виде коллагеновых растений, эта гибкость позволяет исследователю сосредоточиться на конкретных стадиях прогрессирования рака, например, образовании метастатического поражения, инвазии из первичной опухоли или ангиогенезе.
Здесь мы описываем платформу количественного скрининга, которая может быть использована для измерения способности раковых клеток устанавливать инвазивные метастатические поражения. Раковые клетки, которые были трансдуцированы с помощью библиотеки экспрессии, вводятся внутривенно в сосудистую сосудистую клетку CAM при низкой плотности. Метастатические колонии образуются в течение 4-5 дней, затем оценивается инвазионная способность и сосудистое взаимодействие полученных колоний. Отдельные колонии, которые не могут вторгаться, иссякаются, размножаются, и их фенотип подтверждается в CAM путем повторной инжекции и количественной оценки компактности колонии и контактов раковых клеток и кровеносных сосудов. Конструкции библиотеки экспрессии, ответственные за один метастатический колониальный мутантный фенотип, идентифицируются из изолированной колонии геномной ДНК с помощью высокопроизводительного секвенирования. Эта же платформа может быть дополнительно использована для проверки причинно-следственной связи между геном и наблюдаемым фенотипом или для проведения углубленных механистических исследований наблюдаемого фенотипа.
Здесь мы описываем протокол скрининга приживитых прижизвых скринингов на основе быстрой флуоресцентной микроскопии, который может быть использован для важных применений, таких как генетические скрининги или скрининги кандидатов на лекарства. Раковые клетки, которые были трансдуцир?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом Канадского онкологического общества #702849 JDL и KS. Доктор Льюис возглавляет кафедру Фрэнка и Карлы Соджонки в области исследований рака предстательной железы при поддержке Фонда рака Альберты.
1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
PBS (1x) | many sources are available | ||
Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |