Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.
Los avances recientes en la investigación del cáncer han ilustrado la naturaleza altamente compleja de la metástasis del cáncer. Se ha encontrado que múltiples genes o redes de genes están involucrados en la regulación diferencial de los genes en cascada metastásicos del cáncer y los productos genéticos que dependen del tipo de cáncer, el tejido y las características individuales del paciente. Estos representan objetivos potencialmente importantes para la terapéutica genética y los enfoques de medicina personalizada. El desarrollo de plataformas de detección rápida es esencial para la identificación de estas dianas genéticas.
La membrana corioalantoica (CAM) del pollito es una membrana altamente vascularizada y rica en colágeno ubicada debajo de la cáscara del huevo que permite el intercambio de gases en el embrión en desarrollo. Debido a la ubicación y vascularización del CAM, lo desarrollamos como un modelo de metástasis de cáncer humano intravital que permite un xenoinjerto robusto de células cancerosas humanas e imágenes en tiempo real de las interacciones de las células cancerosas con la matriz y la vasculatura ricas en colágeno.
Utilizando este modelo, se diseñó una plataforma de cribado cuantitativo para la identificación de nuevos impulsores o supresores de la metástasis del cáncer. Transducimos un grupo de células cancerosas HEp3 de cabeza y cuello con una biblioteca completa de genes shRNA del genoma humano, luego inyectamos las células, a baja densidad, en la vasculatura CAM. Las células proliferaron y formaron colonias de células tumorales únicas. Las colonias individuales que no pudieron invadir el tejido CAM fueron visibles como un fenotipo de colonia compacta y extirpadas para la identificación del SHRNA transducido presente en las células. Las imágenes de colonias individuales fueron evaluadas por su invasividad. Se realizaron múltiples rondas de selecciones para disminuir la tasa de falsos positivos. Los clones de células cancerosas individuales y aisladas o los clones recién diseñados que expresan genes de interés se sometieron a un ensayo de formación de tumores primarios o a un análisis de cooptación de la vasculatura de células cancerosas. En resumen presentamos una plataforma de cribado rápido que permite la identificación de dianas antitastásicas y el análisis intravital de una cascada dinámica y compleja de eventos.
La metástasis es la principal causa de muerte de pacientes con cáncer1,2,3. Las células cancerosas metastásicas utilizan distintas vías de señalización, dependiendo del tipo de cáncer, a lo largo de los cinco pasos de la cascada metastásica: invasión local, intravasación, supervivencia en la circulación, extravasación y expansión de colonias en sitios metastásicos distantes. La comprensión actual de este proceso metastásico sugiere que hay dos pasos de cuello de botella, uno es la invasión direccional de la célula cancerosa desde el tumor primario, y el segundo es el establecimiento de la lesión metastásica del sitio distante4,5,6. Ambos pasos requieren que las células cancerosas interactúen activamente con el colágeno y la vasculatura en los sitios de invasión inicial o formación de lesiones metastásicas a distancia. Por lo tanto, las células cancerosas metastásicas deben ser capaces de adherirse a las células, remodelar las fibras de colágeno e invadir direccionalmente a lo largo de las paredes vasculares7. Los modelos de detección que pueden identificar rápidamente objetivos terapéuticos antimetastásicos para impedir que las células cancerosas completen estos pasos es de la mayor importancia. Los modelos de detección in vitro existentes no imitan completamente el complejo entorno de tejidos vivos. Los modelos de ratón son costosos y requieren mucho tiempo. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de plataformas de detección intravital que proporcionen entornos complejos de tejidos vivos y una rápida identificación de objetivos.
En la última década, el embrión de pollo se ha establecido como un modelo robusto y rentable de metástasis de cáncer humano8,9,10,11,12. El tejido de la membrana corioalantoica (CAM) del pollito es delgado y translúcido, lo que lo hace ideal para la obtención de imágenes microscópicas intravitales de los comportamientos celulares y de colonias en tumores primarios y/o sitios metastásicos12. El crecimiento del tumor primario a partir de múltiples líneas celulares de cáncer humano puede iniciarse y hacer metástasis en un lapso de solo varios días después de la microinyección en el tejido CAM. Las células cancerosas se pueden administrar en el tejido CAM de varias maneras, incluyendo por vía intravenosa, intra-CAM o como plantas de colágeno, esta flexibilidad permite al investigador centrarse en etapas específicas de la progresión del cáncer, por ejemplo, formación de lesiones metastásicas, invasión del tumor primario o angiogénesis.
Aquí describimos una plataforma de detección cuantitativa que se puede utilizar para medir la capacidad de las células cancerosas para establecer lesiones metastásicas invasivas. Las células cancerosas que han sido transducidas con una biblioteca de expresión se inyectan por vía intravenosa en la vasculatura CAM a baja densidad. Las colonias metastásicas se forman durante 4-5 días, luego se evalúa la capacidad de invasión y la interacción vasculatura de las colonias resultantes. Las colonias individuales que no logran invadir son extirpadas, propagadas y su fenotipo se confirma en el CAM mediante reinyección y cuantificación de la compacidad de la colonia y los contactos entre células cancerosas y vasos sanguíneos. Los constructos de la biblioteca de expresiones responsables del fenotipo mutante de colonia metastásica única se identifican a partir del ADN genómico de colonias aisladas a través de secuenciación de alto rendimiento. La misma plataforma se puede utilizar además para validar el vínculo causal entre un gen y el fenotipo observado o para realizar estudios mecanicistas en profundidad sobre el fenotipo observado.
Aquí describimos un protocolo de detección intravital basado en microscopía de fluorescencia rápida que se puede utilizar para aplicaciones importantes, como pruebas genéticas o candidatas a fármacos. Las células cancerosas que han sido transducidas con una biblioteca genética de interés o transfectadas con construcciones de expresión individual pueden ser rápidamente examinadas y cuantificadas en cuanto al fenotipo de interés utilizando este modelo CAM de pollitos. Dado que los protocolos de transducción o …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la subvención del Instituto de Investigación de la Sociedad Canadiense del Cáncer #702849 a JDL y KS. El Dr. Lewis ocupa la Cátedra Frank y Carla Sojonky en Investigación del Cáncer de Próstata con el apoyo de la Fundación del Cáncer de Alberta.
1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
PBS (1x) | many sources are available | ||
Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |