Il s’agit d’une méthode efficace pour dépister les suppresseurs ou les facteurs de métastases cancéreuses. Les cellules, transduites avec une bibliothèque d’expressions, sont injectées dans le système vasculaire de la membrane chorioallantoïque du poulet pour former des colonies métastatiques. Les colonies ayant un caractère invasif diminué ou accru sont excisées, élargies, réinjectées pour confirmer leur phénotype et, enfin, analysées à l’aide d’un séquençage à haut débit.
Les progrès récents de la recherche sur le cancer ont illustré la nature très complexe des métastases cancéreuses. Il a été constaté que plusieurs gènes ou réseaux de gènes sont impliqués dans la régulation différentielle des gènes en cascade métastatique du cancer et des produits géniques en fonction du type de cancer, des tissus et des caractéristiques individuelles du patient. Ceux-ci représentent des cibles potentiellement importantes pour les thérapies génétiques et les approches de médecine personnalisée. Le développement de plateformes de dépistage rapide est essentiel pour l’identification de ces cibles génétiques.
La membrane chorioallantoïque du poussin (CAM) est une membrane riche en collagène hautement vascularisée située sous la coquille de l’œuf qui permet l’échange de gaz dans l’embryon en développement. En raison de l’emplacement et de la vascularisation du CAM, nous l’avons développé en tant que modèle de métastase cancéreuse humaine intravitale qui permet une xénogreffe robuste des cellules cancéreuses humaines et une imagerie en temps réel des interactions des cellules cancéreuses avec la matrice riche en collagène et le système vasculaire.
À l’aide de ce modèle, une plateforme de dépistage quantitatif a été conçue pour l’identification de nouveaux facteurs ou suppresseurs de métastases cancéreuses. Nous avons transduit un pool de cellules cancéreuses HEp3 de la tête et du cou avec une bibliothèque complète de gènes shRNA du génome humain, puis injecté les cellules, à faible densité, dans le système vasculaire CAM. Les cellules ont proliféré et formé des colonies de cellules monotumorales. Les colonies individuelles qui étaient incapables d’envahir le tissu CAM étaient visibles comme un phénotype de colonie compact et excisées pour l’identification de l’ARNh transducté présent dans les cellules. Les images de colonies individuelles ont été évaluées pour leur caractère envahissant. Plusieurs séries de sélections ont été effectuées pour réduire le taux de faux positifs. Des clones individuels de cellules cancéreuses isolées ou des clones nouvellement modifiés qui expriment des gènes d’intérêt ont été soumis à un test de formation tumorale primaire ou à une analyse de cooptation vasculaire des cellules cancéreuses. En résumé, nous présentons une plateforme de dépistage rapide qui permet l’identification de cibles anti-métastatiques et l’analyse intravitale d’une cascade dynamique et complexe d’événements.
Les métastases sont la principale cause de décès des patients atteints de cancer1,2,3. Les cellules cancéreuses métastatiques utilisent des voies de signalisation distinctes, en fonction du type de cancer, tout au long des cinq étapes de la cascade métastatique: invasion locale, intravasation, survie dans la circulation, extravasation et expansion des colonies sur des sites métastatiques éloignés. La compréhension actuelle de ce processus métastatique suggère qu’il existe deux étapes de goulot d’étranglement, l’une est l’invasion directionnelle de la cellule cancéreuse à partir de la tumeur primaire, et la seconde est l’établissement de la lésion métastatique du site distant4,5,6. Les deux étapes nécessitent que les cellules cancéreuses interagissent activement avec le collagène et le système vasculaire aux sites d’invasion initiale ou de formation de lésions métastatiques à distance. Par conséquent, les cellules cancéreuses métastatiques doivent pouvoir s’attacher aux cellules, remodeler les fibres de collagène et envahir directionnellement le long des parois vasculaires7. Les modèles de dépistage qui peuvent identifier rapidement des cibles thérapeutiques anti-extatiques pour empêcher les cellules cancéreuses de compléter ces étapes sont de la plus haute importance. Les modèles de dépistage in vitro existants n’imitent pas complètement l’environnement complexe des tissus vivants. Les modèles murins sont coûteux et prennent beaucoup de temps. Par conséquent, il existe un besoin urgent de plates-formes de dépistage intravital qui fournissent des environnements tissulaires vivants complexes et une identification rapide des cibles.
Au cours de la dernière décennie, l’embryon de poulet a été établi comme un modèle robuste et rentable de métastases cancéreuses humaines8,9,10,11,12. Le tissu de la membrane chorioallantoïque (CAM) du poussin est mince et translucide, ce qui le rend idéal pour l’imagerie microscopique intravitale des comportements cellulaires et des colonies dans les sites tumoraux primaires et / ou métastatiques12. La croissance tumorale primaire à partir de plusieurs lignées cellulaires cancéreuses humaines peut être initiée et métastasée en l’espace de quelques jours seulement après la microinjection dans le tissu CAM. Les cellules cancéreuses peuvent être administrées dans le tissu CAM de plusieurs façons, y compris par voie intraveineuse, intra-CAM ou sous forme de collagène sur les plantes, cette flexibilité permet au chercheur de se concentrer sur des stades spécifiques de la progression du cancer, par exemple, la formation de lésions métastatiques, l’invasion de la tumeur primaire ou l’angiogenèse.
Nous décrivons ici une plateforme de dépistage quantitatif qui peut être utilisée pour mesurer la capacité des cellules cancéreuses à établir des lésions métastatiques invasives. Les cellules cancéreuses qui ont été transduites avec une bibliothèque d’expression sont injectées par voie intraveineuse dans la vascularisation CAM à faible densité. Les colonies métastatiques se forment pendant 4 à 5 jours, puis la capacité d’invasion et l’interaction vasculaire des colonies résultantes sont évaluées. Les colonies individuelles qui ne parviennent pas à envahir sont excisées, propagées et leur phénotype est confirmé dans le CAM par réinjection et quantification de la compacité des colonies et des contacts cellules cancéreuses-vaisseaux sanguins. Les constructions de la bibliothèque d’expression responsables du phénotype mutant de la colonie métastatique unique sont identifiées à partir de l’ADN génomique de colonie isolée via un séquençage à haut débit. La même plate-forme peut en outre être utilisée pour valider le lien de causalité entre un gène et le phénotype observé ou pour effectuer des études mécanistes approfondies sur le phénotype observé.
Nous décrivons ici un protocole de dépistage intravital basé sur la microscopie à fluorescence rapide qui peut être utilisé pour des applications importantes telles que les criblages génétiques ou candidats médicaments. Les cellules cancéreuses qui ont été transduies avec une bibliothèque génétique d’intérêt ou transfectées avec des constructions d’expression individuelles peuvent être rapidement dépistées et quantifiées quant au phénotype d’intérêt à l’aide de ce modèle CAM de poussin….
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par la subvention de l’Institut de recherche de la Société canadienne du cancer #702849 à JDL et KS. Le Dr Lewis est titulaire de la Chaire Frank et Carla Sojonky en recherche sur le cancer de la prostate soutenue par l’Alberta Cancer Foundation.
1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
PBS (1x) | many sources are available | ||
Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |