Summary

Оценка кристаллического содержания целлюлозы биомассы растений с использованием метода Updegraff

Published: May 15, 2021
doi:

Summary

Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки целлюлозы. Основная цель этой демонстрации заключается в предоставлении подробного протокола Updegraff для оценки содержания целлюлозы в образцах биомассы растений.

Abstract

Целлюлоза является наиболее распространенным полимером на Земле, генерируемым фотосинтезом и основным несущим компонентом клеточных стенок. Клеточная стенка играет значительную роль в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Клеточная стенка в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемичеллозы и пектина. Недавно стенки клеток растений были ориентированы на производство биотоплива и биоэнергии второго поколения. В частности, целлюлозный компонент стенки клеток растения используется для производства целлюлозного этанола. Оценка содержания целлюлозы в биомассе имеет решающее значение для фундаментальных и прикладных исследований клеточной стенки. Метод Updegraff прост, надежн и наиболее широко используется метод для оценки кристаллического содержания целлюлозы биомассы растений. Алкоголь нерастворимых сырой фракции стенки клетки при лечении реагентом Updegraff устраняет гемичеллулозы и лигнина фракций. Позже, Updegraff реагент устойчивых целлюлозы фракция подвергается серной кислоты лечения гидролизов целлюлозы гомополимера в мономерных единиц глюкозы. Регрессионная линия разработана с использованием различных концентраций глюкозы и используется для оценки количества глюкозы, высвобождаемой при целлюлозном гидролизе в экспериментальных образцах. Наконец, содержание целлюлозы оценивается на основе количества мономеров глюкозы по колоритическому анализу антрона.

Introduction

Целлюлоза является основным нагрузоносным компонентом клеточных стенок, который присутствует как в первичных, так и в вторичных клеточных стенках. Клеточная стенка является внеклеточной матрицей, которая окружает растительные клетки и в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемицеллюлозы, пектина и матричных белков. Приблизительно одна треть биомассы растений целлюлозы1 и играет значительную роль в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Хлопковое волокно содержит 95% целлюлозы2 содержание, в то время как деревья содержат от 40% до 50% целлюлозы в зависимости от видов растений итипов органов 3. Целлюлоза состоит из повторяющихся единиц целлобиозы, дисахарид остатков глюкозы, соединенных β-1,4 гликозидионыхсвязей 4. Целлюлозный этанол производится из глюкозы, полученной из целлюлозы, присутствуют в стенках клеток растений5. Целлюлозное волокно состоит из нескольких микро фибрилляций, в которых каждый микро фибриллятор действует как основной блок с 500-15000 мономеровглюкозы 1,6. Целлюлозный гомополимер синтезируется плазменной мембраной встроенных целлюлозно-синтазных комплексов (CSC’s)1,7. Индивидуальные целлюлозные синтазы (CESA) белки синтезируют глюкановые цепи и прилегающие к ним глюкановые цепи соединены водородными связями для формирования кристаллическойцеллюлозы 1,8. Целлюлоза существует в нескольких кристаллических формах с двумя преобладающими формами, целлюлозой I и целлюлозой I, как родные формы9. В высших растениях целлюлоза существует в форме целлюлозы I, в то время как нижняя целлюлоза растений существует вформе I q 10,11. В целом, целлюлоза играет значительную роль в придав прочности и жесткости стенок клеток растений.

Биотопливо первого поколения в основном производится из кукурузного крахмала, тростникового сахара и свеклы сахаров, которые являются источниками пищи, в то время как биотопливо второго поколения фокусируется на производстве биотоплива из непродовольственных растений биомассы клеточный материалстены 12. Точная оценка содержания кристаллической целлюлозы важна не только для фундаментальных исследований биосинтеза целлюлозы и динамики клеточных стенок, но и для прикладных исследований биотоплива и био продуктов. Разработаны и оптимизированы различные методы оценки целлюлозы в биомассе растений, а метод Ульдеграффа является наиболее широко используемым методом оценки целлюлозы. Первый зарегистрированный метод оценки целлюлозы был Кросс и Беван в 1908году 13. Метод был основан на принципе альтернативного хлорирования и экстракции сульфатом натрия. Тем не менее, целлюлоза, полученная в оригинале, а также измененные протоколы Креста и Беван метод показал загрязнение небольших фракций лигнина в дополнение к значительному количеству ксиланов и маннан14. Несмотря на несколько изменений для удаления лигнина и гемичеллозы из целлюлозной фракции, метод Кросс-Беван сохранил значительное количество маннан вместе с целлюлозой. Позже метод Куршнера был разработан с использованием азотной кислоты и этанола для извлечения целлюлозы15. Этот метод заявил, что общий лигнин и 75% пентозанов были удалены, но истинные результаты целлюлозы были такими же, как те, которые оцениваются методом хлорирования Креста и Бевана. Другой метод (Норман и Дженкинс) был разработан с использованием метанола-бензола, сульфата натрия и гипохлорита натрия для извлеченияцеллюлозы 16. Этот метод также сохранил некоторую долю лигнина (3%) и значительное количество пентозанов, что приводит к точной оценке целлюлозы. Позже Кизель и Семигановский использовали другой подход к гидролизной целлюлозе, используя 80% концентрированной серной кислоты, а гидролизированные пониженные сахара оценивались методомБертрана 17. Два метода, Waksman и Стивенс18 и Сало 14,19, которые были разработаны на основе метода Kiesel и Semiganowsky, также дали 4-5% меньше содержания целлюлозы по сравнению с предыдущими методами20.

Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки кристаллического содержания целлюлозы. Этот метод был впервые описан Updegraff для измерения целлюлозы в 1969году 21. Метод Updegraff интегрирует метод Kurschner (использование азотной кислоты), методы Кизела и Семиновского (гидролиз целлюлозы в мономеры глюкозы с использованием серной кислоты) с некоторыми модификациями, и антронный анализ Viles и Silverman для простой колоритной оценки содержания глюкозы икристаллической целлюлозы 22. Принцип этого метода является использование уксусной кислоты и азотной кислоты (Updegraff реагент) для устранения гемичеллозы и лигнина из гомогенизированных тканей растений, что оставляет уксусной / азотной кислоты устойчивых целлюлозы для дальнейшей обработки иоценки 15. Ацетическая/азотная кислотная устойчивая целлюлоза лечится 67% серной кислотой, чтобы разбить целлюлозу на мономерыглюкозы,а выпущенные мономеры глюкозы оцениваются по анализу21,23. Несколько модификаций оригинального метода Updegraff были использованы для упрощения процедуры и оценки целлюлозы с помощью анализа24. В целом этот метод можно разделить на пять этапов. На первом этапе готовится растительный материал. На втором этапе стена сырой клетки отделяется от общей биомассы, так как целлюлоза является ключевым компонентом стенок клеток растений. Позже, в третьей фазе, целлюлоза отделяется от неклеточных компонентов клеточной стенки путем лечения реагентом Updegraff. В четвертой фазе устойчивая к уксусу/азотной кислоте целлюлоза разбита на мономеры глюкозы путем лечения серной кислотой. Серная кислота лечения целлюлозы приводит к образованию 5-гидроксиметилфурфальных соединений от реакции мономеров глюкозы с серной кислотой. Наконец, на последнем этапе, антрон генерирует зеленовато-голубой комплекс путем кипения с меховым соединением, генерируемым в предыдущей фазе25. Этот цветометрический метод на основе антрона был впервые использован в 1942 году Дрейвудом. Антрон является красителем, который определяет меховые соединения пентозы и шестинозных обезвоженных продуктов, таких как 5-гидроксиметилфурфурурал, в кислых условиях. Реакция с шестиосной производит интенсивный цвет и лучший ответ по сравнению с пентозами25. Количество связанной глюкозы измеряется абсорбации спектрофотометра на уровне 620 нм, а интенсивность зеленовато-голубого комплекса прямо пропорциональна количеству сахара в образце. Измеренные значения абсорбции сравнивались со стандартной линией регрессии кривой глюкозы для расчета концентрации глюкозы в образце. Измеренное содержание глюкозы было использовано для оценки содержания целлюлозы в биомассе растения.

Protocol

1. Экспериментальная подготовка Измельчить сушеный растительный материал в мелкий порошок. Белка Solubilization Buffer (PSB): Подготовка фондовых растворов 1 M Tris (рН 8,8), 0,5 М этилендиаминтетраатетической кислоты (EDTA) (рН 8,0) и автоклав их. Сделайте свежий буфер PSB из этих фондовых растворов ?…

Representative Results

Хлопковые растения, выращенные в зеленом доме, были отобраны для этого исследования. Для сравнительного анализа содержания целлюлозы были отобраны две различные экспериментальные линии хлопка. Для каждой экспериментальной линии корневая ткань была собрана из трех биологических репл…

Discussion

Хлопковые волокна являются натуральными волокнами, произведенными из хлопчатобумажного семе. Хлопковое волокно является одной клеткой с содержанием целлюлозы 95%2 с высоким содержанием кристаллической целлюлозы с обширным применением в текстильнойпромышленно?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Департамент растений и почвоведения и хлопка инк за их частичную поддержку этого исследования.

Materials

Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

References

  1. Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
  2. Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
  3. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  4. Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
  5. Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
  6. Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
  7. Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
  8. Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
  9. Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
  10. Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
  11. Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
  12. Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
  13. Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
  14. Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
  15. Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. . Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
  16. Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
  17. Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
  18. Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
  19. Salo, M. -. L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
  20. Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
  21. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
  22. Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
  23. Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
  24. Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
  25. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
  26. Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
  27. Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
  28. Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
  29. Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
  30. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
  31. Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
  32. Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
  33. Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).

Play Video

Cite This Article
Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method. J. Vis. Exp. (171), e62031, doi:10.3791/62031 (2021).

View Video