Summary

Schatting van het kristallijne cellulosegehalte van plantaardige biomassa met behulp van de Updegraff-methode

Published: May 15, 2021
doi:

Summary

De Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor de celluloseschatting. Het belangrijkste doel van deze demonstratie is om een gedetailleerd Updegraff-protocol te bieden voor de schatting van het cellulosegehalte in biomassamonsters van planten.

Abstract

Cellulose is het meest voorkomende polymeer op aarde dat wordt gegenereerd door fotosynthese en de belangrijkste dragende component van celwanden. De celwand speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten door het bieden van kracht, stijfheid, snelheid en richting van celgroei, onderhoud van celvorm en bescherming tegen biotische en abiotische stressoren. De celwand bestaat voornamelijk uit cellulose, lignine, hemicellulose en pectine. Onlangs zijn de celwanden van planten gericht op de productie van biobrandstof en bio-energie van de tweede generatie. In het bijzonder wordt de cellulosecomponent van de plantencelwand gebruikt voor de productie van cellulose-ethanol. Schatting van het cellulosegehalte van biomassa is van cruciaal belang voor fundamenteel en toegepast celwandonderzoek. De Updegraff-methode is eenvoudig, robuust en de meest gebruikte methode voor de schatting van het kristallijne cellulosegehalte van plantaardige biomassa. De alcohol onoplosbare ruwe celwandfractie bij behandeling met Updegraff reagens elimineert de hemicellulose- en ligninefracties. Later wordt de Updegraff reagensresistente cellulosefractie onderworpen aan zwavelzuurbehandeling om het cellulosehomopolymeer te hydrolyseren tot monomere glucose-eenheden. Een regressielijn wordt ontwikkeld met behulp van verschillende concentraties glucose en gebruikt om de hoeveelheid glucose te schatten die vrijkomt bij hydrolyse van cellulose in de experimentele monsters. Ten slotte wordt het cellulosegehalte geschat op basis van de hoeveelheid glucosemonomeren door colorimetrische antroposofietest.

Introduction

Cellulose is de primaire dragende component van celwanden, die aanwezig is in zowel primaire als secundaire celwanden. De celwand is een extracellulaire matrix die plantencellen omringt en bestaat voornamelijk uit cellulose, lignine, hemicellulose, pectine en matrixeiwitten. Ongeveer een derde van de biomassa van planten is cellulose1 en het speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten door kracht, stijfheid, snelheid en richting van celgroei, onderhoud van celvorm en bescherming tegen biotische en abiotische stressoren. Katoenvezel bevat 95% cellulose2-gehalte, terwijl bomen 40% tot 50% cellulose bevatten, afhankelijk van de plantensoort en orgaantypen3. De cellulose bestaat uit herhalende eenheden cellobiose, een disaccharide van glucoseresiduen verbonden door β-1,4 glycosidische bindingen4. Cellulose-ethanol wordt geproduceerd uit de glucose die is afgeleid van de cellulose die aanwezig is in de plantencelwanden5. Cellulosevezel bestaat uit verschillende microfibrils waarin elke microfibril fungeert als kerneenheid met 500-15000 glucosemonomeren1,6. Het cellulosehopolymeer wordt gesynthetiseerd door plasmamembraan ingebedde cellulosesynthasecomplexen (CSC’s)1,7. Individuele cellulosesynthase A (CESA)-eiwitten synthetiseren glucanketens en de aangrenzende glucanketens worden door waterstofbindingen verbonden tot kristallijne cellulose1,8. Cellulose bestaat in verschillende kristallijne vormen met twee overheersende vormen, cellulose Iα en cellulose Iβ als inheemse vormen9. In hogere installaties bestaat cellulose in cellulose Iβ-vorm, terwijl lagere plantaardige cellulose bestaat in Iα-vorm10,11. Over het algemeen speelt de cellulose een belangrijke rol bij het overbrengen van sterkte en stijfheid aan de celwanden van de plant.

Biobrandstoffen van de eerste generatie worden voornamelijk geproduceerd uit maïszetmeel, rietsuikers en bietensuikers, die voedselbronnen zijn, terwijl biobrandstoffen van de tweede generatie zich richten op de productie van biobrandstoffen uit niet-voedsel plantaardig biomassacelwandmateriaal12. Een nauwkeurige schatting van het kristallijne cellulosegehalte is niet alleen belangrijk voor fundamenteel onderzoek naar cellulosebiosynthese en celwanddynamiek, maar ook voor toegepast onderzoek naar biobrandstof en bioproducten. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld en geoptimaliseerd voor het schatten van cellulose in de biomassa van de installatie, en de Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor celluloseschatting. De eerste gerapporteerde methode voor de schatting van cellulose was door Cross en Bevan in 190813. De methode was gebaseerd op het principe van alternatieve chlorering en extractie door natriumsulfaat. De cellulose verkregen door de oorspronkelijke en gewijzigde protocollen van de Cross- en Bevan-methode vertoonde echter verontreiniging van kleine fracties lignine naast een aanzienlijke hoeveelheid xylanen en mannans14. Ondanks verschillende modificaties om lignine en hemicelluloses uit de cellulosefractie te verwijderen, behield de Cross-Bevan-methode een aanzienlijke hoeveelheid mannans samen met cellulose. Later werd Kurschner’s methode ontwikkeld door salpeterzuur en ethanol te gebruiken om cellulose15te extraheren. Deze methode verklaarde dat de totale lignine en 75% van de pentosans werden verwijderd, maar de werkelijke celluloseresultaten waren dezelfde als die welke werden geschat met de chloreringsmethode van Cross en Bevan. Een andere methode (Norman en Jenkins) werd ontwikkeld door gebruik te maken van methanol-benzeen, natriumsulfaat en natriumhypochloriet om cellulose te extraheren16. Deze methode behield ook een fractie lignine (3%) en aanzienlijke hoeveelheden pentosans die leiden tot een nauwkeurige schatting van cellulose. Later gebruikten Kiesel en Semiganowsky een andere benadering van hydrolysecellulose met behulp van 80% geconcentreerd zwavelzuur, en de gehydrolyseerde gereduceerde suikers werden geschat door Bertrand’s methode17. De twee methoden, Waksman’s en Stevens18 en Salo14,19 die werden ontwikkeld op basis van kiesel en Semiganowsky’s methode, leverden ook 4-5% minder cellulosegehalte op in vergelijking met eerdere methoden20.

De Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor de schatting van het kristallijne cellulosegehalte. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Updegraff voor de meting van cellulose in 196921. De Updegraff-methode integreert de Kurschner-methode (gebruik van salpeterzuur), Kiesel- en Seminowsky-methoden (hydrolyse van cellulose in glucosemonomeren met behulp van zwavelzuur) met enkele wijzigingen, en de antroposinetest van Viles en Silverman voor een eenvoudige colorimetrische schatting van het glucose- en kristallijne cellulosegehalte22. Het principe van deze methode is het gebruik van azijnzuur en salpeterzuur (Updegraff-reagens) om hemicellulose en lignine uit de gehomogeniseerde plantenweefsels te verwijderen, waardoor azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose voor verdere verwerking en schatting15. De azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose wordt behandeld met 67% zwavelzuur om de cellulose in glucosemonomeren te breken en de vrijgekomen glucosemonomeren worden geschat door antroposofie21,23. Verschillende wijzigingen van de oorspronkelijke Updegraff-methode werden gebruikt om de procedure en de celluloseraming te vereenvoudigen door antroposofie24. In grote lijnen kan deze methode worden onderverdeeld in vijf fasen. In de eerste fase wordt het plantmateriaal bereid. In de tweede fase wordt de ruwe celwand gescheiden van de totale biomassa, omdat cellulose het belangrijkste onderdeel is van plantencelwanden. Later, in de derde fase, wordt de cellulose gescheiden van de niet-cellulosecelwandcomponenten door behandeling met Updegraff-reagens. In de vierde fase wordt de azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose door zwavelzuurbehandeling in glucosemonomeren afgebroken. Zwavelzuurbehandeling van cellulose resulteert in de vorming van 5-hydroxymethylfurfurale verbindingen uit de reactie van glucosemonomeren met zwavelzuur. Ten slotte genereert het anthrone in de laatste fase een groenblauw complex door te koken met de furfurale verbinding die in de vorige fase25werd gegenereerd . Deze antroposofische colorimetrische methode werd voor het eerst gebruikt in 1942 door Dreywood. Anthrone is een kleurstof die furfurale verbindingen van pentose en hexose gedehydrateerde producten zoals 5-hydroxymethylfurfural identificeert, onder zure omstandigheden. Reactie met hexose produceert een intense kleur en een betere respons in vergelijking met pentoses25. De hoeveelheid gebonden glucose wordt gemeten door spectrofotometerabsorptie bij 620 nm en de intensiteit van het groenblauwe complex is direct evenredig met de hoeveelheid suiker in het monster. De gemeten absorptiewaarden werden vergeleken met een glucosestandaard curveregressielijn om de glucoseconcentratie van het monster te berekenen. Het gemeten glucosegehalte werd gebruikt om het cellulosegehalte van de plantaardige biomassa te schatten.

Protocol

1. Experimentele voorbereiding Maal gedroogd plantmateriaal tot een fijn poeder. Protein Solubilization Buffer (PSB): Bereid stamoplossingen van 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (pH 8,0) en autoclaaf ze. Maak verse PSB-buffer van deze voorraadoplossingen met eindconcentraties van 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA en 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) in steriel water. Bereid 100 ml 70% ethanol (v/v): 70 ml 100% ethanol en 30 ml steriel water. Bereid 100 ml methanol:…

Representative Results

Katoenplanten die in het groene huis werden gekweekt, werden geselecteerd voor deze studie. Voor de vergelijkende analyse van het cellulosegehalte werden twee verschillende experimentele katoenlijnen geselecteerd. Voor elke experimentele lijn werd het wortelweefsel verzameld uit drie biologische replica’s. In totaal werd 500 mg weefsel gehomogeniseerd en 20 mg ervan werd gebruikt voor extractie van ruwe celwanden. Later werd 5 mg ruw celwandextract gebruikt voor updegraff-reagensbehandeling om hemicellulose en lignine ui…

Discussion

Katoenvezels zijn natuurlijke vezels die worden geproduceerd uit het katoenzaad. Katoenvezel is een enkele cel met ~95% cellulosegehalte2 met een hoog kristallijn cellulosegehalte met uitgebreide toepassingen in de textielindustrie31. Omdat katoenvezel ~ 95% cellulose bevat, hebben we katoenwortelweefsels gebruikt om de schatting van het kristallijne cellulosegehalte te demonstreren. Katoenwortelweefsels zijn matig rijk aan kristallijne cellulose en vertegenwoordigen een al…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken het Department of Plant &Soil Science en Cotton Inc. voor hun gedeeltelijke steun aan deze studie.

Materials

Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

References

  1. Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
  2. Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
  3. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  4. Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
  5. Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
  6. Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
  7. Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
  8. Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
  9. Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
  10. Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
  11. Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
  12. Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
  13. Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
  14. Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
  15. Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. . Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
  16. Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
  17. Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
  18. Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
  19. Salo, M. -. L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
  20. Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
  21. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
  22. Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
  23. Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
  24. Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
  25. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
  26. Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
  27. Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
  28. Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
  29. Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
  30. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
  31. Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
  32. Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
  33. Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).

Play Video

Cite This Article
Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method. J. Vis. Exp. (171), e62031, doi:10.3791/62031 (2021).

View Video