Summary

Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts pflanzlicher Biomasse nach der Updegraff-Methode

Published: May 15, 2021
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Summary

Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode für die Zelluloseschätzung. Der Hauptzweck dieser Demonstration besteht darin, ein detailliertes Updegraff-Protokoll zur Schätzung des Zellulosegehalts in pflanzlichen Biomasseproben bereitzustellen.

Abstract

Cellulose ist das am häufigsten vorkommende Polymer auf der Erde, das durch Photosynthese erzeugt wird, und die Haupttragende Komponente von Zellwänden. Die Zellwand spielt eine wichtige Rolle für das Pflanzenwachstum und die Entwicklung, indem sie Kraft, Steifigkeit, Geschwindigkeit und Richtung des Zellwachstums, Zellformerhaltung und Schutz vor biotischen und abiotischen Stressoren bietet. Die Zellwand besteht hauptsächlich aus Cellulose, Lignin, Hemicellulose und Pektin. Kürzlich wurden Pflanzenzellwände für die Biokraftstoff- und Bioenergieproduktion der zweiten Generation ins Visier genommen. Insbesondere wird die Zellulosekomponente der Pflanzenzellwand zur Herstellung von Celluloseethanol verwendet. Die Abschätzung des Zellulosegehalts von Biomasse ist für die grundlagende und angewandte Zellwandforschung von entscheidender Bedeutung. Die Updegraff-Methode ist einfach, robust und die am weitesten verbreitete Methode zur Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts pflanzlicher Biomasse. Die alkoholunlösliche rohzellige Wandfraktion bei behandlung mit Updegraff-Reagenz eliminiert die Hemicellulose- und Ligninfraktionen. Später wird die Updegraff Reagenz-resistente Cellulosefraktion einer Schwefelsäurebehandlung unterzogen, um das Cellulose-Homopolymer in monomere Glukoseeinheiten zu hydrolysieren. Eine Regressionslinie wird mit verschiedenen Glukosekonzentrationen entwickelt und verwendet, um die Menge der Glukose zu schätzen, die bei der Zellulosehydrolyse in den Versuchsproben freigesetzt wird. Schließlich wird der Cellulosegehalt anhand der Menge an Glukosemonomeren durch farbmetrischen Anthronassay geschätzt.

Introduction

Cellulose ist die primäre tragende Komponente von Zellwänden, die sowohl in primären als auch in sekundären Zellwänden vorhanden ist. Die Zellwand ist eine extrazelluläre Matrix, die Pflanzenzellen umgibt und hauptsächlich aus Zellulose, Lignin, Hemicellulose, Pektin und Matrixproteinen besteht. Ungefähr ein Drittel der Pflanzenbiomasse ist Cellulose1 und sie spielt eine wichtige Rolle beim Pflanzenwachstum und der Pflanzenentwicklung, indem sie Stärke, Steifigkeit, Geschwindigkeit und Richtung des Zellwachstums, Zellformerhaltung und Schutz vor biotischen und abiotischen Stressoren bietet. Baumwollfasern enthalten 95%Cellulose-2-Gehalt, während Bäume 40% bis 50% Zellulose je nach Pflanzenart und Organtypen3enthalten. Die Cellulose besteht aus sich wiederholenden Einheiten von Cellobiose, einem Disaccharid von Glukoserückständen, die durch β-1,4 glykosidische Bindungen4verbunden sind. Cellulose-Ethanol wird aus der Glukose hergestellt, die aus der in den Pflanzenzellwänden vorhandenen Zellulose gewonnen wird5. Cellulose Faser besteht aus mehreren Mikrofibrillen, in denen jedes Mikrofibril als Kerneinheit mit 500-15000 Glukosemonomeren1,6fungiert. Das Cellulose-Homopolymer wird durch Plasmamembran-eingebettete Cellulose-Synthase-Komplexe (CSC’s)1,7synthetisiert. Individuelle Cellulosesynthase A (CESA) Proteine synthetisieren Glucanketten und die angrenzenden Glucanketten sind durch Wasserstoffbindungen zu kristalliner Cellulose1,8verbunden. Cellulose existiert in mehreren kristallinen Formen mit zwei vorherrschenden Formen, Cellulose I und Cellulose I als native Formen9. In höheren Pflanzen existiert Cellulose in Zellulose-I-Form, während untere Pflanzenzellulose in I-Form10,11existiert. Insgesamt spielt die Zellulose eine wichtige Rolle bei der Stärkung und Steifigkeit der Pflanzenzellwände.

Biokraftstoffe der ersten Generation werden hauptsächlich aus Maisstärke, Rohrzucker und Rübenzucker hergestellt, die Nahrungsquellen sind, während Biokraftstoffe der zweiten Generation sich auf die Biokraftstoffproduktion aus Biomasse-Zellwandmaterial von Non-Food-Pflanzen konzentrieren12. Die genaue Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts ist nicht nur für die Grundlagenforschung zur Zellulosebiosynthese und Zellwanddynamik wichtig, sondern auch für die Forschung über angewandte Biokraftstoffe und Bioprodukte. Verschiedene Methoden wurden entwickelt und optimiert für die Abschätzung von Zellulose in der pflanzlichen Biomasse, und die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Zelluloseschätzung. Die erste gemeldete Methode zur Zelluloseschätzung wurde von Cross und Bevan 190813gemeldet. Das Verfahren beruhte auf dem Prinzip der alternativen Chlorierung und Extraktion durch Natriumsulfat. Die durch die ursprüngliche sowie modifizierte Protokolle der Cross- und Bevan-Methode erhaltene Cellulose zeigte jedoch eine Kontamination kleiner Ligninfraktionen zusätzlich zu einer erheblichen Menge an Xylanen und Mannanen14. Trotz mehrerer Modifikationen zur Entfernung von Lignin und Hemicellulosen aus der Zellulosefraktion behielt die Cross-Bevan-Methode zusammen mit Cellulose eine beträchtliche Menge an Mannanen bei. Später wurde Kurschners Methode unter Verwendung von Salpetersäure und Ethanol zur Extraktion von Cellulose15entwickelt. Diese Methode besagte, dass die gesamte Lignin und 75% der Pentosane entfernt wurden, aber die wahren Cellulose-Ergebnisse waren die gleichen wie die durch Chlorierungsmethode von Cross und Bevan geschätzt. Eine andere Methode (Norman und Jenkins) wurde unter Verwendung von Methanol-Benzol, Natriumsulfat und Natriumhypochlorit zur Extraktion von Cellulose16entwickelt. Diese Methode behielt auch einen Bruchteil von Lignin (3%) und signifikante Mengen an Pentosanen, die zu einer genauen Schätzung der Zellulose führen. Später verwendeten Kiesel und Semiganowsky einen anderen Ansatz, um Cellulose mit 80% konzentrierter Schwefelsäure zu hydrolysieren, und die hydrolysierten reduzierten Zucker wurden nach Bertrands Methode17geschätzt. Die beiden Methoden, Waksman es und Stevens18 und Salo14,19, die auf der Grundlage der Kiesel- und Semiganowsky-Methode entwickelt wurden, ergaben ebenfalls 4-5% weniger Zellulosegehalt im Vergleich zu früheren Methoden20.

Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts. Diese Methode wurde erstmals von Updegraff für die Messung von Zellulose im Jahr 1969beschrieben 21. Die Updegraff-Methode integriert die Kurschner-Methode (Verwendung von Salpetersäure), Kiesel- und Seminowsky-Methoden (Hydrolyse von Cellulose in Glukosemonomere mit Schwefelsäure) mit einigen Modifikationen und den Anthron-Assay von Viles und Silverman zur einfachen kolorimetrischen Abschätzung des Glukose- und kristallinen Cellulosegehalts22. Das Prinzip dieser Methode ist die Verwendung von Essigsäure und Salpetersäure (Updegraff Reagenz), um Hemicellulose und Lignin aus den homogenisierten Pflanzengeweben zu entfernen, die essig/Salpetersäure-resistente Cellulose zur Weiterverarbeitung und Schätzung15zurücklassen. Die essigsäure-/salpetersäureresistente Cellulose wird mit 67% Schwefelsäure behandelt, um die Cellulose in Glukosemonomere zu brechen und die freigesetzten Glukosemonomere werden durch Anthron-Assay21,23geschätzt. Mehrere Modifikationen der ursprünglichen Updegraff-Methode wurden verwendet, um das Verfahren und die Zelluloseabschätzung durch Anthron-Assay24zu vereinfachen. Im Großen und Ganzen kann diese Methode in fünf Phasen unterteilt werden. In der ersten Phase wird das Pflanzenmaterial vorbereitet. In der zweiten Phase wird die Rohzellwand von der gesamten Biomasse getrennt, da Zellulose der Schlüsselbestandteil von Pflanzenzellwänden ist. Später, in der dritten Phase, wird die Zellulose durch Behandlung mit Updegraff-Reagenz von den nicht-zelluloseischen Zellwandkomponenten getrennt. In der vierten Phase wird die essigsäure-/stickstoffsäureresistente Cellulose durch Schwefelsäurebehandlung in Glukosemonomere gebrochen. Die Schwefelsäurebehandlung von Cellulose führt zur Bildung von 5-Hydroxymethylfurfuralverbindungen aus der Reaktion von Glukosemonomeren mit Schwefelsäure. Schließlich erzeugt der Anthron in der letzten Phase einen grünlich-blauen Komplex durch Kochen mit der furfuralen Verbindung, die in der vorherigen Phase25erzeugt wurde. Diese anthronbasierte kolorimetrische Methode wurde erstmals 1942 von Dreywood verwendet. Anthrone ist ein Farbstoff, der Furfuralverbindungen von Pentose und Hexose dehydrierte Produkte wie 5-Hydroxymethylfurfural identifiziert, unter sauren Bedingungen. Reaktion mit Hexose produziert eine intensive Farbe und bessere Reaktion im Vergleich zu Pentoses25. Die Menge der gebundenen Glukose wird durch Spektralphotometer-Absorption bei 620 nm gemessen und die Intensität des grünlich-blauen Komplexes ist direkt proportional zur Zuckermenge in der Probe. Die gemessenen Absorptionswerte wurden mit einer Regressionslinie der Glukose-Standardkurve verglichen, um die Glukosekonzentration der Probe zu berechnen. Der gemessene Glukosegehalt wurde verwendet, um den Zellulosegehalt der pflanzenden Biomasse zu schätzen.

Protocol

1. Experimentelle Zubereitung Getrocknetes Pflanzenmaterial zu einem feinen Pulver mahlen. Protein-Solubilisationspuffer (PSB): Bereiten Sie Lagerlösungen von 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 8.0) vor und autoklavn Sie sie. Machen Sie aus diesen Lagerlösungen einen frischen PSB-Puffer mit Endkonzentrationen von 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA und 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) in sterilem Wasser. 100 ml 70% Ethanol (v/v): 70 ml 100% Ethanol und 30 ml steriles Wasse…

Representative Results

Für diese Studie wurden Baumwollpflanzen ausgewählt, die im grünen Haus angebaut wurden. Für die vergleichende Analyse des Zellulosegehalts wurden zwei verschiedene Versuchslinien aus Baumwolle ausgewählt. Für jede versuchsweise Linie wurde das Wurzelgewebe aus drei biologischen Repliken entnommen. Insgesamt 500 mg Gewebe wurde homogenisiert und 20 mg davon wurde für die Rohzellwandextraktion verwendet. Später wurden 5 mg Rohzell-Wandextrakt zur Behandlung von Updegraff-Reagenzien verwendet, um Hemicellulose und …

Discussion

Baumwollfasern sind Naturfasern, die aus dem Baumwollsaat hergestellt werden. Baumwollfaser ist eine Einzelzelle mit einem Cellulosegehalt von95 % 2 mit hohem kristallinem Zellulosegehalt mit umfangreichen Anwendungen in der Textilindustrie31. Da Baumwollfasern 95 % Cellulose enthalten, haben wir Baumwollwurzelgewebe verwendet, um die Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts zu demonstrieren. Baumwollwurzelgewebe sind mäßig reich an kristallinem Zellulosegehalt und st…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem Department of Plant & Soil Science und Cotton Inc. für die teilweise Unterstützung dieser Studie.

Materials

Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

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Cite This Article
Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method. J. Vis. Exp. (171), e62031, doi:10.3791/62031 (2021).

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