Summary

הערכת תכולת תאית גבישית של ביומסה צמחית בשיטת Updegraff

Published: May 15, 2021
doi:

Summary

שיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית. המטרה העיקרית של הדגמה זו היא לספק פרוטוקול Updegraff מפורט להערכת תכולת תאית בדגימות ביומסה צמחית.

Abstract

תאית היא הפולימר הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ שנוצר על ידי פוטוסינתזה והמרכיב העיקרי נושא העומס של קירות התא. קיר התא ממלא תפקיד משמעותי בצמיחה ובהתפתחות הצמח על ידי מתן כוח, קשיחות, קצב וכיוון של צמיחת תאים, תחזוקת צורת תאים והגנה מפני לחצים ביוטיים ואביוטיים. דופן התא מורכבת בעיקר תאית, ליגנין, hemicellulose ופקטין. לאחרונה קירות תאי הצמח היו ממוקדים לייצור דלק ביולוגי וביו-אנרגיה מהדור השני. באופן ספציפי, רכיב תאית של דופן התא הצמח משמש לייצור אתנול צלולוסי. הערכה של תוכן תאית של ביומסה היא קריטית למחקר בסיסי ויישומי של דופן התא. שיטת Updegraff היא פשוטה, חזקה, ואת השיטה הנפוצה ביותר להערכת תוכן תאית גבישית של ביומסה צמחית. האלכוהול מסיסים תאים גולמיים החלק על הטיפול עם ריאגנט Updegraff מבטל את שברי hemicellulose ו ליגנין. מאוחר יותר, חלק תאית עמיד ריאגנט Updegraff נתון לטיפול חומצה גופרתית כדי הידרוליזה הומופולימר תאית ליחידות גלוקוז מונומרי. קו רגרסיה מפותח באמצעות ריכוזים שונים של גלוקוז ומשמש להערכת כמות הגלוקוז המשתחרר על הידרוליזה תאית בדגימות הניסוי. לבסוף, התוכן תאית מוערך בהתבסס על כמות מונומרים גלוקוז על ידי בדיקת אנתרון צבעוני.

Introduction

תאית היא המרכיב העיקרי נושא העומס של קירות התא, אשר קיים הן בקירות התא הראשי והן בקירות התא המשני. דופן התא היא מטריצה חוץ-תאית המקיפה תאי צמחים ומורכבת בעיקר מחלבוני תאית, ליגנין, המיצלולוז, פקטין ומטריצה. כשליש מהביומסה של הצמחים היא תאית1 והיא ממלאת תפקידים משמעותיים בצמיחה ובהתפתחות הצמח על ידי מתן כוח, קשיחות, קצב וכיוון של צמיחת תאים, תחזוקת צורת תאים והגנה מפני גורמי לחץ ביוטיים ואביוטיים. סיבי כותנה מכילים 95% תאית2 תוכן, בעוד עצים מכילים 40% עד 50% של תאית בהתאם למין הצמח וסוגי איברים3. התאית מורכבת מיחידות חוזרות של צ’לוביוז, מפרק של שאריות גלוקוז המחוברות על ידי β-1,4 קשרים גליקופידיים4. אתנול צלולוסי מופק מן הגלוקוז נגזר תאית נוכח בקירות תא הצמח5. סיבים צלולוסיים מורכבים ממספר סיבי מיקרו שבהם כל סיב מיקרו פועל כיחידת ליבה עם מונומרים גלוקוז 500-150001,6. homopolymer תאית מסונתז על ידי קרום פלזמה מוטבע קומפלקסים סינתאז תאית (CSC)1,7. חלבוני סינתאז תאית בודדים A (CESA) מסנתזים שרשראות גלוקן ושרשראות הגלוקן הסמוכות מחוברות באמצעות קשרי מימן ליצירת תאית גבישית1,8. תאית קיימת במספר צורות גבישיות עם שתי צורות דומיננטיות, תאית Iα ו תאית Iβ כצורות מקוריות9. בצמחים גבוהים יותר, תאית קיימת בצורת תאית Iβ בעוד תאית הצמח התחתון קיים בצורת Iα10,11. בסך הכל, התאית ממלאת תפקיד משמעותי בהקניית כוח ונוקשות לקירות תאי הצמח.

דלקים ביולוגיים מהדור הראשון מיוצרים בעיקר מעמילן תירס, סוכרי קנים וסוכרי סלק, שהם מקורות מזון, ואילו דלקים ביולוגיים מהדור השני מתמקדים בייצור דלק ביולוגי מחומר קיר תא ביומסה שאינו מזון12. הערכה מדויקת של תכולת תאית גבישית חשובה לא רק למחקר בסיסי על ביוסינתזה תאית ודינמיקה של דופן התא, אלא גם למחקר יישומי של דלק ביולוגי ומוצרי ביו. שיטות שונות פותחו ואופטימיזציה להערכת תאית בביומסה הצמחית, ושיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית. השיטה המדווחת הראשונה להערכת תאית הייתה על ידי קרוס ובבן בשנת 190813. השיטה התבססה על העיקרון של כלור חלופי ומיצוי על ידי נתרן גופרתי. עם זאת, תאית שהושגה על ידי המקורי, כמו גם פרוטוקולים שונה של שיטת קרוס בוואן הראה זיהום של שברים קטנים של ליגנין בנוסף כמות משמעותית של xylans ו mannans14. למרות מספר שינויים להסרת ליגנין והמיצלולוזים מהשבר התאי, שיטת Cross-Bevan שמרה על כמות ניכרת של מנאנים יחד עם תאית. מאוחר יותר, השיטה של Kurschner פותחה על ידי שימוש בחומצה חנקתית ואתנול כדי לחלץ תאית15. שיטה זו קבעה כי סך ליגנין ו 75% של pentosans הוסרו אבל התוצאות תאית האמיתית היו זהים לאלה המוערכים על ידי שיטת כלור של קרוס בוואן. שיטה נוספת (נורמן וג’נקינס) פותחה על ידי שימוש במתנול-בנזן, נתרן סולפט ונתרן היפוכלוריט לחילוץ תאית16. שיטה זו גם שמרה על חלק קטן של ליגנין (3%) וכמויות משמעותיות של פנטוסנים המובילות להערכת תאית מדויקת. מאוחר יותר, Kiesel ו Semiganowsky השתמשו בגישה שונה כדי הידרוליזה תאית באמצעות 80% מרוכז חומצה גופרתית, ואת סוכרים מופחתים הידרוליזה הוערכו על ידי השיטה של ברטרנד17. שתי השיטות, של וקסמן וסטיבנס18 וסאלו14,19 שפותחו על בסיס השיטה של קיזל וסמיגנובסקי, הניבו גם 4-5% פחות תוכן תאית בהשוואה לשיטותקודמות 20.

שיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תכולת תאית גבישית. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Updegraff למדידת תאית בשנת 196921. שיטת Updegraff משלבת את שיטת קורשנר (שימוש בחומצה חנקתית), שיטות קיזל וסמינובסקי (הידרוליזה של תאית לתוך מונומרים של גלוקוז באמצעות חומצה גופרתית) עם כמה שינויים, ואת מבחני האנתרון של ויילס וסילברמן להערכת צבעים פשוטה של גלוקוז ותכולת תאית גבישית22. העיקרון של שיטה זו הוא השימוש בחומצה אצטית וחומצה חנקתית (מגיב Updegraff) כדי לחסל hemicellulose ו ליגנין מרקמות הצמח הומוגנית, אשר משאיר תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית לעיבוד נוסף והערכת15. תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית מטופלת עם 67% חומצה גופרתית כדי לשבור את תאית לתוך מונומרים גלוקוז מונומרים גלוקוז שוחרר מוערך על ידי anthrone assay21,23. מספר שינויים בשיטת Updegraff המקורית שימשו כדי לפשט את ההליך ואת הערכת תאית על ידי anthrone assay24. באופן כללי, ניתן לחלק שיטה זו לחמישה שלבים. בשלב הראשון, החומר הצמחי מוכן. בשלב השני, קיר התא הגולמי מופרד מן הביומסה הכוללת, כמו תאית היא המרכיב העיקרי של קירות התא הצמח. מאוחר יותר, בשלב השלישי, התאית מופרדת מרכיבי דופן התא הלא צלולוסי על ידי טיפול עם ריאגנט Updegraff. בשלב הרביעי, תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית מחולק מונומרים גלוקוז על ידי טיפול חומצה גופרתית. טיפול חומצה גופרתית של תוצאות תאית היווצרות של תרכובות 5-hydroxymethylfurfural מהתגובה של מונומרים גלוקוז עם חומצה גופרתית. לבסוף, בשלב האחרון, האנתרון יוצר קומפלקס כחול ירקרק על ידי רותחים עם תרכובת furfural שנוצר בשלב הקודם25. שיטה קוורימטרית מבוססת אנתרון זו שימשה לראשונה בשנת 1942 על ידי דרייווד. אנתרון הוא צבע המזהה תרכובות פורפורליות של מוצרים מיובשים פנטוז ו hexose כגון 5-hydroxymethylfurfural, בתנאים חומציים. תגובה עם הקסוס מייצרת צבע אינטנסיבי ותגובה טובה יותר בהשוואה pentoses25. כמות הגלוקוז המאוגד נמדדת על ידי ספיגת ספקטרופוטומטר ב 620 ננומטר ואת עוצמת קומפלקס כחול ירקרק הוא פרופורציונלי ישירות לכמות הסוכר במדגם. ערכי הספיגה הנמדדים הושוו לקו רגרסיה של עקומת גלוקוז סטנדרטית לחישוב ריכוז הסוכר של המדגם. תכולת הגלוקוז הנמדדת שימשה להערכת תכולת תאית של ביומסה הצמח.

Protocol

1. הכנה ניסיונית טוחנים חומר צמחי מיובש לאבקה דקה. מאגר סולובליזציה של חלבונים (PSB): הכינו פתרונות מלאי של 1 M Tris (pH 8.8), 0.5 M חומצה אתילנדיאמיאנטטראקטית (EDTA) (pH 8.0) ומובלעת אותן אוטומטית. הפוך מאגר PSB טרי מפתרונות מלאי אלה עם ריכוזים סופיים של 50 mM Tris, 0.5 מ”מ EDTA ו 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) במים …

Representative Results

צמחים כותנה גדל בבית הירוק נבחרו למחקר זה. שני קווים ניסיוניים שונים של כותנה נבחרו לניתוח השוואתי של תכולת תאית. עבור כל קו ניסיוני, רקמת השורש נאספה משלושה משכפלים ביולוגיים. סך של 500 מ ג של רקמה היה הומוגני ו 20 מ ג של זה שימש להפקת דופן התא הגולמי. מאוחר יותר, 5 מ”ג של תמצית דופן התא הגולמי שי…

Discussion

סיבי כותנה הם סיבים טבעיים המיוצרים מן זרעי הכותנה. סיבי כותנה הוא תא יחיד עם ~ 95% תוכן תאית2 עם תוכן תאית גבישי גבוה עם יישומים נרחבים בתעשיית הטקסטיל31. כמו, סיבי כותנה מכיל ~ 95% תאית, השתמשנו ברקמות שורש כותנה להדגמה של הערכת תוכן תאית גבישית. רקמות שורש כותנה עשירו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים למחלקה למדעי הקרקע והכותנה בע”מ על תמיכתם החלקית במחקר זה.

Materials

Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

References

  1. Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
  2. Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
  3. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  4. Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
  5. Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
  6. Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
  7. Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
  8. Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
  9. Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
  10. Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
  11. Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
  12. Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
  13. Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
  14. Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
  15. Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. . Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
  16. Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
  17. Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
  18. Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
  19. Salo, M. -. L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
  20. Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
  21. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
  22. Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
  23. Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
  24. Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
  25. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
  26. Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
  27. Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
  28. Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
  29. Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
  30. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
  31. Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
  32. Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
  33. Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).

Play Video

Cite This Article
Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method. J. Vis. Exp. (171), e62031, doi:10.3791/62031 (2021).

View Video