Moleküler Analiz için Serebellar Bölgesel Diseksiyon
Summary
Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA’yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.
Abstract
Serebellum, hareket kontrolü, denge, biliş, ödül ve etki dahil olmak üzere çeşitli temel işlevlerde önemli bir rol oynar. Görüntüleme çalışmaları farklı serebellar bölgelerin bu farklı fonksiyonlara katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bölgesel serebellar farklılıkları inceleyen moleküler çalışmalar, çoğunlukla serebellar özlerin tamamında yapıldığı için geride kalmaktadır ve böylece belirli serebellar bölgelerdeki ayrımları maskelemektedir. Burada dört farklı serebellar bölgeyi tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama tekniğini açıklıyoruz: derin serebellar çekirdek (DCN), ön ve arka vermal serebellar korteks ve yarımkürelerin serebellar korteksi. Bu farklı bölgelerin diseksiyonunun, denge, hareket, etki ve bilişe benzersiz katkılarının altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin verir. Bu teknik, çeşitli fare hastalığı modellerinde bu belirli bölgelerin patolojik duyarlılığındaki farklılıkları araştırmak için de kullanılabilir.
Introduction
Beyincik beyindeki nöronların yarısından fazlasını içerir ve tarihsel olarak beyinde motor kontrol ve denge merkezi olarak adlandırılır1. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar serebellumun biliş, ödül işleme dahil olmak üzere diğer çeşitli işlevlerde kilit bir rol oynadığını ve 2 , 3,4,5‘i etkilediğinigöstermiştir.
Beyincik iyi tanımlanmış anatomiye sahiptir: korteks bölgesi granül, Purkinje ve moleküler katmanlardan oluşur. Granül hücreler granül hücre tabakasını oluşturur ve paralel lifler aracılığıyla moleküler tabakanın Purkinje hücre dendritlerine giriş gönderir ve bu da alt zeytinden kaynaklanan tırmanma liflerinden giriş alır. Purkinje hücreleri, beyincikten ana çıktı görevi gören derin serebellar çekirdekteki (DCN) hücrelere inhibitör projeksiyonlar gönderir. Bu serebellar devrenin çıkışı, Golgi, stellat ve sepet hücreleri de dahil olmak üzere serebellar korteksteki inhibitör internöronların aktivitesi ile daha da modüle edilir4. Bu serebellar fonksiyonel ünite serebellar korteksin tüm lobüllerine dağılmıştır. Beyincik boyunca bu nispeten düzgün devreye rağmen, insan nörogörüntüleme literatüründen ve hasta çalışmalarından elde edilen kanıtlar beyincik6,7’ninfonksiyonel heterojenliğini göstermektedir.
Serebellar korteks iki ana bölgeye ayrılabilir: orta çizgi tanımlı vermis ve lateral yarımküreler. Vermis daha da ön ve arka lobüllere ayrılabilir. Beyinciklerin bu farklı bölgeleri farklı davranışlara katkıda bulunmakla suçlanmıştır. Görev çağrışan veya görevsiz aktivite kalıpları, vermis’in ön bölgelerinin motor fonksiyona daha fazla katkıda bulunduğunu, posterior vermis’in ise biliş6,7’yedaha fazla katkıda bulunduğunu ortaya çıkardı. Vermis ayrıca etki ve duygularla bağlantılıdır, serebellar yarımküreler yürütme, görsel-mekansal, dil ve diğer anımsatıcı işlevlere katkıda bulunur8. Ek olarak, anatomik çalışmalar fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin farklı kortikal bölgelerle bağlantılı olduğuna dair kanıtlar sağlamıştır9. Lezyon semptom haritalaması, ön lobları etkileyen inmeleri olan hastaların (lob VI’ya kadar uzanan) ince motor görevlerde daha düşük performansa sahip olduğunu, arka lob bölgelerinde ve yarımkürelerde hasarı olan hastaların serebellar motor sendromunun yokluğunda bilişsel eksiklikler sergilediğini ortaya koydu10. Son olarak, hastalıkta bölgesel serebellar patoloji, fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin de hastalığa farklı şekilde duyarlı olduğunu gösterir11,12.
Çok daha az araştırılsa da, ön kanıtlar serebellar kortikal bölgelerde belirgin gen ekspresyon imzaları göstermektedir. Zebrin II’nin Purkinje hücre ifadesi, vermiste bölgeye özgü desenleme gösterir, böylece arka lobüllerde daha fazla Zebrin II pozitif hücre ve ön lobüllerde dahaazdır 13. Bu aynı zamanda Zebrin II negatif Purkinje hücreleri Zebrin II pozitif14olan Purkinje hücrelerinden daha yüksek tonik ateşleme sıklığı gösterdiğinden bölgesel olarak farklı fizyolojik işlevle de ilişkilidir.
Serebellar kortekse ek olarak, serebellum, beyincik için birincil çıktı görevi gören derin serebellar çekirdeği (DCN) içerir. Çekirdekler medial (MN), interposed (IN) ve lateral çekirdeklerden (LN) oluşur. Fonksiyonel görüntüleme ve hasta çalışmaları, DCN’nin çeşitli davranışlara da katıldığını göstermiştir15, ancak çok az çalışma DCN’deki gen ekspresyon değişimini inceler.
Moleküler tekniklerdeki gelişmeler beyindeki bölgesel gen ekspresyonun değerlendirilmesini mümkün kıldı ve hem fizyolojik hem de hastalık durumlarında farklı beyin bölgelerinde ve içinde heterojenliği ortaya çıkardı16. Bu tür çalışmalar, beyinciğerinin diğer beyin bölgelerinden farklı olduğunu ima eder. Örneğin, nöronların glial hücrelere oranı beyincikte diğer beyin bölgelerine göre ters çevrilmiş1. Normal fizyolojik koşullarda bile, proinflamatuar genlerin ekspresyonu beyincikte diğer beyin bölgelerine göre artmaktadır17. Moleküler teknikler, serebellar hastalıkların patogenezine katkıda bulunan yolların tanımlanmasında da çok yararlı olmuştur. Örneğin, tüm serebellar özlerin RNA dizilimi, vahşi tip kontrollerine kıyasla spinocerebellar ataksi tip 1’in (SCA1) Purkinje hücresine özgü transgenik fare modelinde değiştirilen genleri tanımladı. Bu tür kanıtlar, serebellar Purkinje hücrelerinde patogenezin altında kalan temel moleküler yolları ortaya çıkarmıştır ve potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olmuştur18. Bununla birlikte, son çalışmalar serebellar bölgelerde hastalıklara karşı savunmasızlıkta farklılıklar olduğunu göstermektedir11,12,19. Bu, tüm serebellar özlerle maskelenmiş veya tespit edilmemiş olabilecek farklı serebellar bölgelerde meydana gelen önemli değişiklikler olduğunu gösterebilir. Bu nedenle, araştırmacıların farklı serebellar bölgelerdeki moleküler profilleri incelemelerini sağlayan teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır.
Burada önerilen teknik, RNA’yı bu bölgelerden izole etmek ve gen ifadesindeki bölgesel farklılıkları araştırmak için fare beyinciğinin dört farklı bölgesini parçalamak için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Şekil 1A’daki fare beyinciliğinin şeması, vermis’i mavi ve yarımküreleri sarı renkle vurgular. Özellikle, Bu teknik dört bölgenin izole olmasını mümkün kılar: derin serebellar çekirdek (DCN) (Şekil 1A’dakikırmızı noktalı kutular), ön vermis (CCaV) serebellar korteksi (koyu mavi inç) Şekil 1A), arka vermis (CCpV) serebellar korteksi (Şekil 1A’daaçık mavi) ve yarımkürelerin serebeller korteksi (CCH) (Şekil 1A’dasarı). Bu bölgelerin gen ekspresyonunun ayrı ayrı değerlendirilmesi ile bu farklı bölgelerin ayrık fonksiyonlarının altında kalan moleküler mekanizmaların yanı sıra hastalıktaki kırılganlıklarındaki potansiyel farklılıkların araştırılması mümkün olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntem, dört ayrı serebellar bölgede altta kalan gen ekspresyonunu ve moleküler mekanizmaların değerlendirilmesini mümkün kılar – derin serebellar çekirdek (DCN), vermisin ön serebellar korteksi (CCaV), vermisin arka serebellar korteksi (CCpV) ve yarımkürelerin serebellar korteksi (CCH). Bu bölgeleri ayrı ayrı değerlendirme yeteneği, belirli serebellar bölgelerin heterojenliği hakkındaki bilgimizi genişletecek ve muhtemelen çeşitli davranışlara katkılarına ışık tutacakt?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cvetanovic laboratuvarındaki Austin Ferro ve Juao-Guilherme Rosa’ya, diseksiyonların giderilmesinde ve RNA ekstraksiyonu ve RTqPCR’de yardımları için minnettarız. Bu araştırma M. Cvetanovic, R01 NS197387 tarafından finanse edilir; HHS | Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH).
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region – dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. . From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , (2020).
