Cerebellaire regionale dissectie voor moleculaire analyse
Summary
Verschillende cerebellaire regio’s zijn betrokken om een rol te spelen in verschillende gedragsoutputs, maar de onderliggende moleculaire mechanismen blijven onbekend. Dit werk beschrijft een methode om de cerebellaire cortex van de hemisferen, voorste en achterste gebieden van de vermis en de diepe cerebellaire kernen reproduceerbaar en snel te ontleden om moleculaire verschillen te onderzoeken door RNA te isoleren en te testen op verschillen in genexpressie.
Abstract
Cerebellum speelt een belangrijke rol in verschillende belangrijke functies, waaronder controle van beweging, evenwicht, cognitie, beloning en invloed. Beeldvormende studies geven aan dat verschillende cerebellaire regio’s bijdragen aan deze verschillende functies. Moleculaire studies die regionale cerebellaire verschillen onderzoeken, blijven achter, omdat ze meestal worden gedaan op hele cerebellaire extracten, waardoor elk onderscheid tussen specifieke cerebellaire regio’s wordt gemaskeerd. Hier beschrijven we een techniek om vier verschillende cerebellaire gebieden reproduceerbaar en snel te ontleden: de diepe cerebellaire kernen (DCN), de voorste en achterste verale cerebellaire cortex en de cerebellaire cortex van de hemisferen. Het ontleden van deze verschillende regio’s maakt het mogelijk om moleculaire mechanismen te verkennen die ten grondslag kunnen liggen aan hun unieke bijdragen aan evenwicht, beweging, invloed en cognitie. Deze techniek kan ook worden gebruikt om verschillen in pathologische gevoeligheid van deze specifieke regio’s tussen verschillende muisziektemodellen te onderzoeken.
Introduction
Het cerebellum bevat meer dan de helft van de neuronen in de hersenen en is historisch aangeduid als een motorische controle en evenwicht centrum in de hersenen1. Meer recentelijk hebben studies aangetoond dat het cerebellum een sleutelrol speelt in verschillende andere functies, waaronder cognitie, beloningsverwerking en2,3,4,5beïnvloedt .
Het cerebellum heeft een goed beschreven anatomie: het cortexgebied bestaat uit korrels, Purkinje en moleculaire lagen. Korrelcellen vormen de korrelcellaag en sturen via parallelle vezels input naar de Purkinje-celdendrieten van de moleculaire laag die ook input ontvangen van klimvezels die afkomstig zijn van de inferieure olijf. Purkinje-cellen sturen remmende projecties naar cellen in de diepe cerebellaire kernen (DCN), die dient als de belangrijkste output van het cerebellum. De output van dit cerebellaire circuit wordt verder gemoduleerd door de activiteit van de remmende interneurons in de cerebellaire cortex, waaronder Golgi, stellaat en mandcellen4. Deze cerebellaire functionele eenheid is verdeeld over alle lobules van de cerebellaire cortex. Ondanks deze relatief uniforme circuits over het cerebellum wijst bewijs uit menselijke neuroimaging literatuur en patiëntenstudies op functionele heterogeniteit van het cerebellum6,7.
De cerebellaire cortex kan worden onderverdeeld in twee hoofdgebieden: de middellijngedefinieerde vermis en de laterale hemisferen. De vermis kan verder worden onderverdeeld in voorste en achterste lobules. Deze verschillende gebieden van het cerebellum zijn betrokken bij het bijdragen aan verschillende gedragingen. Taak-opgeroepen of taakvrije activiteitspatronen impliceerden dat voorste gebieden van de vermis meer bijdragen aan de motorische functie, terwijl posterieure vermis meer bijdraagt aan cognitie6,7. De vermis is ook verbonden met affect en emoties, terwijl cerebellaire hemisferen bijdragen aan uitvoerende, visueel-ruimtelijke, taal en andere mnemonische functies8. Bovendien leverden anatomische studies bewijs dat functioneel verschillende cerebellaire regio’s verbonden zijn met verschillende corticale regio’s9. Laesiesymptomen in kaart gebracht bleek dat patiënten met beroertes die de voorste lobules aantasten (die zich uitstrekken tot lobule VI) slechtere prestaties hadden bij fijne motorische taken, terwijl patiënten met schade aan achterste kwabregio’s en hemisferen cognitieve tekorten vertoonden bij afwezigheid van cerebellair motorisch syndroom10. Ten slotte geeft regionale cerebellaire pathologie bij ziekten aan dat functioneel verschillende cerebellaire regio’s ook verschillend vatbaar zijn voor ziekte11,12.
Hoewel veel minder onderzocht, toont voorlopig bewijs verschillende genexpressiesignaturen aan in cerebellaire corticale regio’s. Purkinje celexpressie van Zebrin II toont regiospecifieke patronen in de vermis zodanig dat er meer Zebrin II positieve cellen in de achterste lobules en minder in de voorste lobules13. Dit correleert ook met regionaal onderscheidende fysiologische functie als Zebrin II negatieve Purkinje cellen vertonen een hogere frequentie van tonic vuren dan Purkinje cellen die Zebrin II positief14.
Naast de cerebellaire cortex omvat het cerebellum de diepe cerebellaire kernen (DCN) die dienen als de primaire output voor het cerebellum. De kernen bestaan uit de mediale (MN), interposed (IN) en laterale kernen (LN). Functionele beeldvorming en patiëntstudies hebben aangetoond dat de DCN ook deelneemt aan verschillende gedragingen15, maar zeer weinig studies onderzoeken genexpressieverandering in DCN.
Vooruitgang in moleculaire technieken heeft het mogelijk gemaakt om regionale genexpressie in de hersenen te beoordelen en heeft heterogeniteit in en binnen verschillende hersengebieden in zowel fysiologische als ziektetoestanden blootgelegd16. Dergelijke studies impliceren dat het cerebellum verschilt van andere hersengebieden. De verhouding van neuronen tot gliacellen wordt bijvoorbeeld omgekeerd in het cerebellum in vergelijking met andere hersengebieden1. Zelfs in normale fysiologische omstandigheden wordt de expressie van pro-inflammatoire genen geüreguleerd in het cerebellum in vergelijking met de andere hersengebieden17. Moleculaire technieken zijn ook zeer nuttig geweest bij het identificeren van de paden die bijdragen aan de pathogenese van cerebellaire ziekten. Bijvoorbeeld, RNA sequencing van de hele cerebellaire extracten geïdentificeerd genen veranderd in een Purkinje cel specifieke transgene muis model van spinocerebellaire ataxie type 1 (SCA1) in vergelijking met hun wild type controles. Dergelijk bewijs heeft belangrijke moleculaire routes onthuld die ten grondslag liggen aan pathogenese in cerebellaire Purkinje-cellen en heeft geholpen bij het identificeren van potentiële therapeutische doelen18. Recente studies suggereren echter dat er verschillen zijn in de kwetsbaarheid voor ziekten in de cerebellaire regio ‘s11,12,19. Dit kan erop wijzen dat er belangrijke veranderingen optreden in verschillende cerebellaire regio’s, die kunnen worden gemaskeerd of onopgemerkt met hele cerebellaire extracten. Er is dus behoefte aan technieken waarmee onderzoekers moleculaire profielen in verschillende cerebellaire gebieden kunnen onderzoeken.
De hier voorgestelde techniek beschrijft een reproduceerbare methode om vier verschillende gebieden van het muis cerebellum te ontleden om RNA van die gebieden te isoleren en regionale verschillen in genexpressie te onderzoeken. Het schema van het muis cerebellum in figuur 1A markeert de vermis in blauw en hemisferen in geel. In het bijzonder maakt deze techniek het mogelijk om vier regio’s te isoleren: diepe cerebellaire kernen (DCN) (roodgestippelde vakken in figuur 1A),de cerebellaire cortex van voorste vermis (CCaV) (donkerblauw in figuur 1A),de cerebellaire cortex van de posterieure vermis (CCpV) (lichtblauw in figuur 1A)en de cerebellaire cortex van de hemisferen (CCH) (geel in figuur 1A). Door de genexpressie van deze regio’s afzonderlijk te beoordelen, zal het mogelijk zijn om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan discrete functies van deze verschillende regio’s, evenals potentiële verschillen in hun kwetsbaarheid voor ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode maakt het mogelijk om de onderliggende genexpressie en moleculaire mechanismen binnen vier verschillende cerebellaire gebieden te beoordelen – de diepe cerebellaire kernen (DCN), de voorste cerebellaire cortex van de vermis (CCaV), de achterste cerebellaire cortex van de vermis (CCpV) en de cerebellaire cortex van de hemisferen (CCH). Het vermogen om deze regio’s afzonderlijk te beoordelen zal onze kennis van de heterogeniteit van specifieke cerebellaire regio’s uitbreiden en mogelijk licht wer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Austin Ferro en Juao-Guilherme Rosa in het Cvetanovic-lab dankbaar voor hun hulp bij het oplossen van dissecties en bij RNA-extractie en RTqPCR. Dit onderzoek wordt gefinancierd door M. Cvetanovic, R01 NS197387; HHS | Nationale Instituten voor Gezondheid (NIH).
Materials
| 1.5 Microcentrifuge tubes | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Isopropyl Alcohol | VWR Life sciences | 1106C361 | |
| 200 ul Pipet tips | GeneMate | P-1237-200 | |
| Adult Mouse Brain Matrix Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Blunt forceps | |||
| Chloroform | Macron | 220905 | |
| Decapitation Scissors | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Ethyl Alcohol | Pharmco | 111000200 | |
| Glass Slide (for electrophoresis) | BIORAD | ||
| Homogenizer | Kimble | 6HAZ6 | |
| Ice Bucket | |||
| Insulin Syringe (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatula | |||
| Needle Nose forceps | |||
| Petri Dish | Pyrex | ||
| Primetime Primer for Aldolase C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Single Edge Rzor Blades | Personna GEM | ||
| Sterile, sigle-use pestles | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Reagent | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Vascular Scissors |
References
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
- Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
- Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
- Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
- King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
- Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
- Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
- Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
- Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
- Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
- Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
- Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
- Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
- Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
- Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region – dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
- Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
- Cendelin, J. . From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
- Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , (2020).
