Summary

Региональное рассечение мозжечка для молекулярного анализа

Published: December 05, 2020
doi:

Summary

Различные мозжечковые области были замешаны в том, чтобы играть роль в различных поведенческих выходах, но основные молекулярные механизмы остаются неизвестными. В этой работе описывается метод воспроизводимого и быстрого рассечения коры мозжечка полушарий, передней и задней областей вермиса и глубоких ядер мозжечка с целью исследования молекулярных различий путем выделения РНК и тестирования различий в экспрессии генов.

Abstract

Мозжечок играет важную роль в нескольких ключевых функциях, включая контроль движения, равновесия, познания, вознаграждения и аффекта. Исследования изображений показывают, что различные мозжечковые области способствуют этим различным функциям. Молекулярные исследования, изучающие региональные различия мозжечка, отстают, поскольку они в основном проводятся на целых экстрактах мозжечка, тем самым маскируя любые различия в конкретных мозжечковых областях. Здесь мы описываем технику воспроизводимого и быстрого рассечения четырех различных мозжечковых областей: глубоких ядер мозжечка (DCN), передней и задней вермальной мозжечковой коры и мозжечковой коры полушарий. Анализ этих различных областей позволяет исследовать молекулярные механизмы, которые могут лежать в основе их уникального вклада в баланс, движение, аффект и познание. Этот метод также может быть использован для изучения различий в патологической восприимчивости этих конкретных областей в различных моделях заболеваний мышей.

Introduction

Мозжечок содержит более половины нейронов в мозге и исторически упоминается как центр управления и равновесия в мозге1. Совсем недавно исследования показали, что мозжечок играет ключевую роль в различных других функциях, включая познание, обработку вознаграждения и влияние2,3,4,5.

Мозжечок имеет хорошо описанную анатомию: область коры состоит из гранул, Пуркинье и молекулярных слоев. Грануляные клетки образуют грануляный клеточный слой и посылают вход через параллельные волокна в клеточные дендриты Пуркинье молекулярного слоя, которые также получают входные данные от вьющихся волокон, возникших в нижней оливе. Клетки Пуркинье посылают ингибирующие проекции клеткам в глубоких мозжечковых ядрах (DCN), которые служат основным выходом из мозжечка. Выход этого мозжечкового контура дополнительно модулируется активностью ингибирующих интернейронов в коре мозжечка, включая гольджи, звездчатые и корзинчатые клетки4. Этот мозжечковой функциональный блок распределен по всем долочкам коры мозжечка. Несмотря на эту относительно однородную схему по всему мозжечку, данные из литературы по нейровизуализации человека и исследований пациентов указывают на функциональную гетерогенность мозжечка6,7.

Кору мозжечка можно разделить на две основные области: среднюю, определенную вермисом, и боковые полушария. Вермис можно далее разделить на переднюю и заднюю дольки. Эти различные области мозжечка были причастны к содействию различному поведению. Паттерны активности, вызванные задачами или без задач, связаны с тем, что передние области вермиса вносят больший вклад в двигательную функцию, в то время как задние вермисы вносят больший вклад в познание6,7. Вермис также связан с аффектами и эмоциями, в то время как полушария мозжечка способствуют исполнительным, визуально-пространственным, языковым и другим мнемоническим функциям8. Кроме того, анатомические исследования предоставили доказательства того, что функционально различные мозжечковые области связаны с различными областями коры9. Картирование симптомов поражения показало, что пациенты с инсультами, затрагивающими передние дольки (распространяющиеся в дольку VI), имели более низкую производительность при выполнении мелкомоторных задач, в то время как пациенты с повреждением областей задней доли и полушарий демонстрировали когнитивный дефицит при отсутствии мозжечкового моторного синдрома10. Наконец, регионарная мозжечковая патология при заболевании указывает на то, что функционально различные мозжечковые области также по-разному восприимчивы к заболеванию11,12.

Хотя предварительные данные гораздо менее изучены, они демонстрируют различные сигнатуры экспрессии генов в мозжечковых корковых областях. Экспрессия клеток Пуркинье Зебрина II показывает специфическую для области структуру в вермисе, так что в задних дочках больше положительных клеток Зебрина II и меньше в передних долеках13. Это также коррелирует с регионально отличной физиологической функцией, поскольку отрицательные клетки Зебрина II Пуркинье демонстрируют более высокую частоту тонического возбуждения, чем клетки Пуркинье, которые являются положительными Зебрином II14.

В дополнение к коре мозжечка, мозжечок включает глубокие мозжечковые ядра (DCN), которые служат основным выходом для мозжечка. Ядра состоят из медиал (MN), интерпозиции (IN) и боковых ядер (LN). Функциональная визуализация и исследования пациентов продемонстрировали, что DCN также участвует в различных поведенческих действиях15,но очень немногие исследования изучают изменение экспрессии генов в DCN.

Достижения в области молекулярных методов позволили оценить региональную экспрессию генов в мозге и выявили гетерогенность между и внутри различных областей мозга как в физиологическом, так и в заболевании состояний16. Такие исследования показывают, что мозжечок отличается от других областей мозга. Например, отношение нейронов к глиальным клеткам инвертируется в мозжечке по сравнению с другими областями мозга1. Даже в нормальных физиологических условиях экспрессия провоспалительных генов повышается в мозжечке по сравнению с другими областями мозга17. Молекулярные методы также были очень полезны для выявления путей, которые способствуют патогенезу мозжечковых заболеваний. Например, секвенирование РНК всех экстрактов мозжечка идентифицировало гены, измененные в специфической для клетки Пуркинье трансгенной мышиной модели спиноцеребеллярной атаксии типа 1 (SCA1) по сравнению с их контролем дикого типа. Такие данные выявили ключевые молекулярные пути, лежащие в основе патогенеза в мозжечковых клетках Пуркинье, и помогли идентифицировать потенциальные терапевтические мишени18. Однако последние исследования показывают, что существуют различия в уязвимости к заболеваниям в мозжечковых областях11,12,19. Это может указывать на то, что существуют ключевые изменения, происходящие в различных мозжечковых областях, которые могут быть замаскированы или незамечены целыми экстрактами мозжечка. Таким образом, существует необходимость в разработке методов, которые позволят исследователям изучать молекулярные профили в различных мозжечковых областях.

Предлагаемый здесь метод описывает воспроизводимый метод рассечения четырех различных областей мозжечка мыши, чтобы изолировать РНК из этих областей и исследовать региональные различия в экспрессии генов. Схема мозжечка мыши на рисунке 1А выделяет вермис синим цветом, а полушария желтым. В частности, этот метод позволяет выделить четыре области: глубокие ядра мозжечка (DCN) (красные пунктирные коробки на рисунке 1A),мозжечковая кора передней вермисы (CCaV) (темно-синий на рисунке 1A),мозжечковая кора задней вермисы (CCpV) (светло-синяя на рисунке 1A)и мозжечковая кора полушарий (CCH) (желтый на рисунке 1A). Оценивая экспрессию генов этих областей отдельно, можно будет исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе дискретных функций этих различных областей, а также потенциальные различия в их уязвимости при заболевании.

Protocol

1. Настройка Соберите необходимое оборудование, включая обезглавленные ножницы, тупые щипцы, ножницы для рассечения, сосудистые ножницы, микропатул, сагиттальную матрицу мозга мыши, лезвия бритвы, наконечники пипетки 200 мкл, стеклянную чашку Петри, стеклянную горку и ведр…

Representative Results

Для этих экспериментов использовались четыре одиннадцатинедельные самки диких мышей типа C57/Black6. Одна мышь использовалась для проведения полного рассечения мозжечка, которое называется «объемным мозжечком» и позволяло сравнивать уровни РНК в рассеченных областях с…

Discussion

Метод, описанный здесь, позволяет оценить экспрессию основных генов и молекулярные механизмы в четырех различных мозжечковых областях – глубоких ядрах мозжечка (DCN), передней мозжечковой коре вермиса (CCaV), задней мозжечковой коре вермиса (CCpV) и коре мозжечка полушарий (CCH). Возможность оц?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Остину Ферро и Жуао-Гильерме Розе в лаборатории Цветановича за их помощь в устранении неполадок вскрытий и в экстракции РНК и RTqPCR. Данное исследование финансируется М. Цветановичем, R01 NS197387; | HHS Национальные институты здравоохранения (NIH).

Materials

1.5 Microcentrifuge tubes ThermoScietific 3456
100% Isopropyl Alcohol VWR Life sciences 1106C361
200 ul Pipet tips GeneMate P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal Kent Scientific Corporation RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform Macron 220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol Pharmco 111000200
Glass Slide (for electrophoresis) BIORAD
Homogenizer Kimble 6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml) BD 329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR BIORAD 1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C IDT Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4 IDT Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin IDT Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18  IDT Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles FisherScientific 12141364
TRIzol Reagent Ambion by Life technologies 15596018
Vascular Scissors

References

  1. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  2. Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the cerebellum. Brain. 129 (2), 290-292 (2006).
  3. Badura, A., et al. Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity. eLife. 7, 36401 (2018).
  4. Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains. Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).
  5. Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. Cerebellum and Nonmotor Function. Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).
  6. King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery. Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).
  7. Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity. Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).
  8. Schmahmann, J. D. From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing. Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).
  9. Kelly, R. M., Strick, P. L. Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate. The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).
  10. Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke. NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).
  11. Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Brain. 139 (5), (2016).
  12. Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia. NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).
  13. Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. Cerebellum. The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).
  14. Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).
  15. Manto, M., Oulad Ben Taib, N. Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures. The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).
  16. Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1. eLife. , (2018).
  17. Grabert, K., et al. Microglial brain region – dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).
  18. Ingram, M., et al. Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways. Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).
  19. Cendelin, J. . From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).
  20. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  21. Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner. Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).
  22. Chopra, R., et al. Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1. Human Molecular Genetics. , (2020).

Play Video

Cite This Article
Hamel, K. A., Cvetanovic, M. Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis. J. Vis. Exp. (166), e61922, doi:10.3791/61922 (2020).

View Video