Summary

Disección regional cerebelosa para análisis molecular

Published: December 05, 2020
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Summary

Se ha implicado que diferentes regiones cerebelosas desempeñan un papel en distintos resultados conductuales, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. Este trabajo describe un método para diseccionar de manera reproducible y rápida la corteza cerebelosa de los hemisferios, las regiones anterior y posterior del vermis y los núcleos cerebelosos profundos con el fin de sondear las diferencias moleculares mediante el aislamiento del ARN y la prueba de las diferencias en la expresión génica.

Abstract

El cerebelo juega un papel importante en varias funciones clave, incluido el control del movimiento, el equilibrio, la cognición, la recompensa y el afecto. Los estudios de imágenes indican que las distintas regiones cerebelosas contribuyen a estas diferentes funciones. Los estudios moleculares que examinan las diferencias cerebelosas regionales están rezagados, ya que se realizan principalmente en extractos cerebelosos enteros, enmascarando así cualquier distinción en regiones cerebelosas específicas. Aquí describimos una técnica para diseccionar de manera reproducible y rápida cuatro regiones cerebelosas diferentes: los núcleos cerebelosos profundos (DCN), la corteza cerebelosa vermal anterior y posterior y la corteza cerebelosa de los hemisferios. La disección de estas distintas regiones permite la exploración de los mecanismos moleculares que pueden subyacer a sus contribuciones únicas al equilibrio, el movimiento, el afecto y la cognición. Esta técnica también se puede utilizar para explorar las diferencias en la susceptibilidad patológica de estas regiones específicas en varios modelos de enfermedad de ratón.

Introduction

El cerebelo contiene más de la mitad de las neuronas en el cerebro e históricamente se ha referido como un centro de control motor y equilibrio en el cerebro1. Más recientemente, los estudios han demostrado que el cerebelo juega un papel clave en varias otras funciones, incluida la cognición, el procesamiento de recompensas y afectana 2,3,4,5.

El cerebelo tiene una anatomía bien descrita: la región de la corteza está compuesta de gránulos, Purkinje y capas moleculares. Las células granulares forman la capa celular granulada y envían entrada a través de fibras paralelas a las dendritas celulares de Purkinje de la capa molecular que también reciben entrada de fibras trepadoras que se originaron en la aceituna inferior. Las células de Purkinje envían proyecciones inhibitorias a las células en los núcleos cerebelosos profundos (DCN), que sirve como la principal salida del cerebelo. La salida de este circuito cerebeloso se modula aún más por la actividad de las interneuronas inhibitorias en la corteza cerebelosa, incluidas las células de Golgi, estrelladas y cesta4. Esta unidad funcional cerebelosa se distribuye por todos los lóbulos de la corteza cerebelosa. A pesar de este circuito relativamente uniforme a través del cerebelo, la evidencia de la literatura de neuroimagen humana y los estudios de pacientes indican heterogeneidad funcional del cerebelo6,7.

La corteza cerebelosa se puede dividir en dos regiones principales: el vermis definido en la línea media y los hemisferios laterales. El vermis se puede dividir en lóbulos anterior y posterior. Estas distintas regiones del cerebelo han sido implicadas en contribuir a diferentes comportamientos. Los patrones de actividad evocados por tareas o sin tareas implicaron que las regiones anteriores del vermis contribuyen más a la función motora, mientras que el vermis posterior contribuye más a la cognición6,7. El vermis también está relacionado con el afecto y las emociones, mientras que los hemisferios cerebelosos contribuyen a las funciones ejecutivas, visuales-espaciales, del lenguaje y otras funciones mnemotécnicas8. Además, los estudios anatómicos proporcionaron evidencia de que las regiones cerebelosas funcionalmente distintas están conectadas con diferentes regiones corticales9. El mapeo lesión-síntoma reveló que los pacientes con accidentes cerebrovasculares que afectan los lóbulos anteriores (que se extienden hacia el lóbulo VI) tuvieron un rendimiento más pobre en las tareas motoras finas, mientras que los pacientes con daño en las regiones del lóbulo posterior y los hemisferios exhibieron déficits cognitivos en ausencia de síndrome motor cerebeloso10. Finalmente, la patología cerebelosa regional en la enfermedad indica que las regiones cerebelosas funcionalmente distintas también son susceptibles de manera diferente a la enfermedad11,12.

Aunque mucho menos explorada, la evidencia preliminar demuestra distintas firmas de expresión génica en las regiones corticales cerebelosas. La expresión celular de Purkinje de Zebrin II muestra patrones específicos de la región en el vermis de tal manera que hay más células positivas de Zebrin II en los lóbulos posteriores y menos en los lóbulos anteriores13. Esto también se correlaciona con una función fisiológica regionalmente distinta, ya que las células de Purkinje negativas de Zebrin II muestran una mayor frecuencia de disparo tónico que las células de Purkinje que son Zebrin IIpositivas 14.

Además de la corteza cerebelosa, el cerebelo incluye los núcleos cerebelosos profundos (DCN) que sirven como la salida primaria para el cerebelo. Los núcleos están formados por los núcleos medial (MN), interpuesto (IN) y lateral (LN). Las imágenes funcionales y los estudios de pacientes han demostrado que el DCN también participa en varios comportamientos15, pero muy pocos estudios examinan el cambio de la expresión génica en dcN.

Los avances en las técnicas moleculares han hecho posible evaluar la expresión génica regional en el cerebro y han descubierto heterogeneidad a través y dentro de diferentes regiones del cerebro tanto en estados fisiológicos como de enfermedad16. Tales estudios implican que el cerebelo es diferente de otras regiones del cerebro. Por ejemplo, la proporción de neuronas a células gliales se invierte en el cerebelo en comparación con otras regiones del cerebro1. Incluso en condiciones fisiológicas normales, la expresión de genes proinflamatorios está regulada al alza en el cerebelo en comparación con las otras regiones del cerebro17. Las técnicas moleculares también han sido muy útiles para identificar las vías que contribuyen a la patogénesis de las enfermedades cerebelosas. Por ejemplo, la secuenciación de ARN de los extractos cerebelosos completos identificó genes alterados en un modelo de ratón transgénico específico de células de Purkinje de ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) en comparación con sus controles de tipo salvaje. Dicha evidencia ha revelado vías moleculares clave que subyacen a la patogénesis en las células cerebelosas de Purkinje y ha ayudado a identificar posibles objetivos terapéuticos18. Sin embargo, estudios recientes sugieren que existen diferencias en la vulnerabilidad a las enfermedades en las regiones cerebelosas11,12,19. Esto podría indicar que hay cambios clave que ocurren en distintas regiones cerebelosas, que pueden enmascararse o no detectarse con extractos cerebelosos completos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar técnicas que permitan a los investigadores examinar los perfiles moleculares en diferentes regiones cerebelosas.

La técnica propuesta aquí describe un método reproducible para diseccionar cuatro regiones distintas del cerebelo de ratón con el fin de aislar el ARN de esas regiones y explorar las diferencias regionales en la expresión génica. El esquema del cerebelo del ratón en la Figura 1A resalta el vermis en azul y los hemisferios en amarillo. En concreto, esta técnica permite aislar cuatro regiones: núcleos cerebelosos profundos (DCN) (cuadros de puntos rojos en la Figura 1A),la corteza cerebelosa del vermis anterior (CCaV) (azul oscuro en la Figura 1A),la corteza cerebelosa del vermis posterior (CCpV) (azul claro en la Figura 1A),y la corteza cerebelosa de los hemisferios (CCH) (amarillo en la Figura 1A). Al evaluar la expresión génica de estas regiones por separado, será posible investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las funciones discretas de estas diferentes regiones, así como las posibles diferencias en su vulnerabilidad a la enfermedad.

Protocol

1. Configuración Reúna el equipo necesario, incluidas las tijeras de decapitación, las yempadoras romas, las tijeras de disección, las tijeras vasculares, la microespatula, la matriz cerebral del ratón sagital, las cuchillas de afeitar, las puntas de pipeta de 200 μL, la placa de Petri de vidrio, el portaobjetos de vidrio y el cubo de hielo. Coloca todo el equipo en una almohadilla absorbente. Coloque la placa de Petri, la placa de vidrio y la matriz cerebral sobre hielo. …

Representative Results

Para estos experimentos, se utilizaron cuatro ratones salvajes hembra de once semanas de edad tipo C57 / Black6. Se utilizó un ratón para realizar una disección cerebelosa completa que se conoce como “cerebelo a granel” y permitió la comparación de los niveles de ARN en regiones disecadas con una disección completa. Los otros tres ratones se utilizaron para realizar la disección cerebelosa descrita en este protocolo. El uso de tres ratones permite garantizar que las tendencias dete…

Discussion

El método descrito aquí permite evaluar la expresión génica subyacente y los mecanismos moleculares dentro de cuatro regiones cerebelosas distintas: los núcleos cerebelosos profundos (DCN), la corteza cerebelosa anterior del vermis (CCaV), la corteza cerebelosa posterior del vermis (CCpV) y la corteza cerebelosa de los hemisferios (CCH). La capacidad de evaluar estas regiones por separado ampliará nuestro conocimiento de la heterogeneidad de regiones cerebelosas específicas y posiblemente arrojará luz sobre su co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Austin Ferro y Juao-Guilherme Rosa en el laboratorio de Cvetanovic por su ayuda en la resolución de problemas de disecciones y en la extracción de ARN y RTqPCR. Esta investigación está financiada por M. Cvetanovic, R01 NS197387; | del HHS Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Materials

1.5 Microcentrifuge tubes ThermoScietific 3456
100% Isopropyl Alcohol VWR Life sciences 1106C361
200 ul Pipet tips GeneMate P-1237-200
Adult Mouse Brain Matrix Sagittal Kent Scientific Corporation RBMA-200S
Blunt forceps
Chloroform Macron 220905
Decapitation Scissors
Dissecting Scissors
Ethyl Alcohol Pharmco 111000200
Glass Slide (for electrophoresis) BIORAD
Homogenizer Kimble 6HAZ6
Ice Bucket
Insulin Syringe (.5ml) BD 329461
iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR BIORAD 1725037
Micro Spatula
Needle Nose forceps
Petri Dish Pyrex
Primetime Primer for Aldolase C IDT Mm.PT.58>43415246
Primetime Primer for Kcng4 IDT Mm.PT.56a.9448518
Primetime Primer for Parvalbumin IDT Mm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18  IDT Mm.PT.58.12109666
Single Edge Rzor Blades Personna GEM
Sterile, sigle-use pestles FisherScientific 12141364
TRIzol Reagent Ambion by Life technologies 15596018
Vascular Scissors

References

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Cite This Article
Hamel, K. A., Cvetanovic, M. Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis. J. Vis. Exp. (166), e61922, doi:10.3791/61922 (2020).

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