Summary

Um pequeno RNA não codificante MicC contribui para a virulência em proteínas da membrana externa em Salmonella enteritidis

Published: January 27, 2021
doi:

Summary

Um sistema de recombinação mediado por λ-Red foi usado para criar um mutante de deleção de um pequeno micC de RNA não-codificante.

Abstract

Um pequeno RNA não codificante (sRNA) é um novo fator para regular a expressão gênica em nível pós-transcricional. Uma espécie de sRNA MicC, conhecido em Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, poderia reprimir a expressão de proteínas da membrana externa. Para investigar melhor a função de regulação do micC em Salmonella Enteritidis, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis e, em seguida, construímos o mutante 50336Δ micC pelo sistema de recombinação baseado em λ Red e o mutante complementado 50336Δ micC/p micC carregando plasmídeo recombinante pBR322 expressando micC. Os resultados da qRT-PCR demonstraram que a transcrição de ompD em 50336Δ micC foi 1,3 vezes maior do que na cepa selvagem, enquanto a transcrição de ompA e ompC em 50336ΔmicC foi 2,2 vezes maior e 3 vezes maior do que na cepa selvagem. Estes indicaram que micC reprime a expressão de ompA e ompC. No estudo seguinte, a patogenicidade de 50336ΔmicC foi detectada por camundongos Balb/c de 6 semanas de idade e galinhas de 1 dia de idade. O resultado mostrou que a DL 50 da linhagem selvagem 50336, os mutantes 50336Δ micC e 50336Δ micC/p micC para camundongos Balb/c com 6 semanas de idade foram 12,59 UFC, 5,01 UFC e 19,95 UFC, respectivamente. As DL 50 das cepas para frangos de 1 dia de idade foram 1,13 x 109 UFC, 1,55 x 10 8 UFC e2,54 x 10 8 UFC, respectivamente. Isso indicou que a deleção de micC aumentou a virulência de S. Enteritidis em camundongos e galinhas regulando a expressão de proteínas da membrana externa.

Introduction

Os pequenos RNAs não codificantes (sRNAs) têm 40-400 nucleotídeos de comprimento, que geralmente não codificam proteínas, mas podem ser transcritos independentemente em cromossomos bacterianos 1,2,3. A maioria dos sRNAs é codificada nas regiões intergênicas (IGRs) entre regiões codificadoras de genes e interage com mRNAs alvo por meio de ações de pareamento de bases e regula a expressão de genes-alvo em nível pós-transcricional 4,5. Desempenham importantes papéis de regulação no metabolismo de substâncias, síntese de proteínas de membrana externa, quorum sensing e expressão gênica de virulência5.

MicC é um transcrito de RNA pequeno de 109 nucleotídeos presente em Escherichia coli e Salmonella enterica sorovar Typhimurium, que poderia regular a expressão de múltiplas proteínas de membrana externa, como OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 e Omp36 6,7,8,9. O MicC regula a expressão de OmpC inibindo a ligação do ribossomo ao líder de mRNA ompC in vitro e requer a chaperona de RNA Hfq para sua função em Escherichia coli6. Em Salmonella Typhimurium, MicC silencia o mRNA ompD através de um duplex de RNA de ≤12 pb dentro da sequência codificadora (códons 23-26) e, em seguida, desestabiliza o mRNA endonucleolítico7. Este processo de regulação é assistido pela proteína chaperona Hfq10. A OmpC é uma proteína abundante da membrana externa que foi considerada importante em ambientes onde as concentrações de nutrientes e toxinas eram elevadas, como no intestino6. A porina OmpD é a proteína de membrana externa mais abundante em Salmonella Typhimurium e representa cerca de 1% da proteína celular total11. A OmpD está envolvida na aderência a macrófagos humanos e células epiteliais intestinais12. MicC também reprime a expressão de porinas OmpC e OmpD. Acredita-se que MicC pode regular a virulência. Para explorar novos genes-alvo regulados por MicC e estudar a função de regulação de virulência do micC, clonamos o gene micC na cepa 50336 de Salmonella Enteritidis (SE) e, em seguida, construímos o mutante 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/p micC. Novos genes-alvo foram rastreados por qRT-PCR. A virulência de 50336ΔmicC foi detectada por infecções em camundongos e galinhas.

Protocol

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals do Conselho Nacional de Pesquisa. O comitê de cuidados e uso de animais da Universidade de Yangzhou aprovou todos os experimentos e procedimentos aplicados nos animais (SYXK2016-0020). 1. Cepas bacterianas, plasmídeos e condições de cultura Utilizar as bactérias e plasmídeos listados na Tabela 1. Cultivar bactérias em caldo LB ou em placas de ágar…

Representative Results

Construção do mutante 50336Δ micC e linhagem complementada 50336Δ micC /p micCO resultado do clone do gene micC indicou que este gene era composto por 109 pb mostrando 100% de identidade com o de S. Typhimurium. Com base nos dados de sequência, o mutante de deleção 50336ΔmicC e o mutante complementado 50336ΔmicC/pmicC for…

Discussion

S. A enteritidis é um importante patógeno intracelular facultativo que pode infectar galinhas jovens e produzir sintomas desde enterite até infecção sistêmica e morte17,18. Além disso, S. Enteritidis causa infecções latentes em frangos adultos e portadores crônicos contaminam produtos avícolas, resultando em infecções transmitidas por alimentos em humanos19. O mecanismo patogênico de S. Enteritidis …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência da China (Nos. 31972651 e 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), Um Projeto Financiado pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD).

Materials

dextrose Sangon Biotech A610219 for broth preparation
DNA purification kit TIANGEN DP214 for DNA purification
Ex Taq TaKaRa RR01A PCR
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent 10017608 for broth preparation
K2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent 20032116 for broth preparation
L-Arabinose Sangon Biotech A610071 λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit TIANGEN DP106 plasmid extraction
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 for broth preparation
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser  TaKaRa RR047 qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II TaKaRa RR820 qRT-PCR
T4 DNA Ligase NEB M0202 Ligation
TRIzol  Invitrogen 15596018 RNA isolation
Tryptone Oxoid LP0042 for broth preparation
Yeast extract Oxoid LP0021 for broth preparation
centrifuge Eppendorf 5418 centrifugation
Electrophoresis apparatus Bio-Rad 164-5050 Electrophoresis
 Electroporation System Bio-Rad 165-2100 for bacterial transformation
Spectrophotometer BioTek Epoch Absorbance detection
Real-Time PCR system Applied Biosystems 7500 system qRT-PCR

References

  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

Play Video

Cite This Article
Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang, J., Wang, J., Zhu, G. A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis. J. Vis. Exp. (167), e61808, doi:10.3791/61808 (2021).

View Video