Summary

암호화되지 않은 작은 RNA MicC는 살모넬라 엔테리티디스의 외막 단백질에서 독성에 기여합니다

Published: January 27, 2021
doi:

Summary

λ-적색 매개 재조합 시스템을 사용하여 작은 비암호화 RNA micC의 결실 돌연변이를 생성했습니다.

Abstract

비코딩 소형 RNA(sRNA)는 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절하는 새로운 인자입니다. 대장균(Escherichia coli)과 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에 알려진 일종의 sRNA MicC는 외막 단백질의 발현을 억제할 수 있습니다. 살모넬라 엔테리티디스에서 micC의 조절 기능을 추가로 조사하기 위해, 우리는 살모넬라 엔테리티디스 균주 50336에서 micC 유전자를 클로닝한 다음, λ 적색 기반 재조합 시스템에 의해 돌연변이 50336Δ micC를 구성하고 micC를 발현하는 재조합 플라스미드 pBR322를 운반하는 보완된 돌연변이 50336Δ micC/p micC를 구성했습니다. qRT-PCR 결과는 50336Δ micC에서 ompD의 전사가 야생형 균주보다 1.3배 더 높은 반면, 50336ΔmicC에서 ompA 및 ompC의 전사 는 야생형 균주보다 2.2배 및 3배 더 높았다. 이들은 micC가 ompA 및 ompC의 발현을 억제한다는 것을 나타내었다. 다음 연구에서, 50336ΔmicC의 병원성은 6주령의 Balb/c 마우스와 1일령의 닭 모두를 감염시켜 검출되었다. 그 결과, 6주령 Balb/c 마우스에 대한 야생형 균주 50336의LD50, 돌연변이체 50336ΔmicC 및 50336Δ micC/pmicC가 각각 12.59 CFU, 5.01 CFU 및 19.95 CFU인 것으로 나타났다. 1 일 된 닭에 대한 균주의LD50은 각각 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 10 8 CFU 및 2.54 x 108 CFU였다. micC의 결실이 S의 독성을 증가시킨다는 것을 나타내었다. Enteritidis는 외막 단백질의 발현을 조절하여 생쥐와 닭에서 발생합니다.

Introduction

비암호화 소형 RNA(sRNA)는 길이가 40-400 뉴클레오티드로, 일반적으로 단백질을 암호화하지 않지만 박테리아 염색체 1,2,3에서 독립적으로 전사될 수 있습니다. 대부분의 sRNA는 유전자 코딩 영역 사이의 유전자 간 영역(IGR)에 암호화되어 염기쌍 작용을 통해 표적 mRNA와 상호 작용하고 전사 후 수준에서 표적 유전자 발현을 조절합니다 4,5. 물질 대사, 외막 단백질 합성, 정족수 감지 및 독성 유전자 발현에서 중요한 조절 역할을 한다5.

MicC는 대장균살모넬라 엔테리카 혈청형 티피무리움에 존재하는 109-뉴클레오티드 소RNA 전사체로, OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 및 Omp36 6,7,8,9와 같은 다중 외막 단백질 발현을 조절할 수 있습니다. MicC는 시험관 내에서 ompC mRNA 리더에 대한 리보솜 결합을 억제하여 OmpC의 발현을 조절하며 대장균6에서 기능을 위해 Hfq RNA 샤페론이 필요합니다. 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에서 MicC는 코딩 서열(코돈 23-26) 내의 ≤12-bp RNA 이중체를 통해 ompD mRNA를 침묵시킨 다음 내핵분해 mRNA7을 불안정화시킵니다. 이 조절 과정은 샤페론 단백질 Hfq10에 의해 지원됩니다. OmpC는 장과 같이 영양소와 독소 농도가 높은 환경에서 중요하다고 생각되는 풍부한 외막 단백질입니다6. OmpD 포린은 살모넬라 티피무리움에서 가장 풍부한 외막 단백질이며 전체 세포 단백질11의 약 1%를 차지합니다. OmpD는 인간 대식세포와 장 상피세포에 대한 순응에 관여한다12. MicC는 또한 OmpC 및 OmpD 포린 모두의 발현을 억제합니다. MicC는 독성을 조절할 수 있다고 생각됩니다. MicC에 의해 조절되는 새로운 표적 유전자를 탐색하고 micC의 독성 조절 기능을 연구하기 위해 살모넬라 엔테리티디스(SE) 균주 50336에서 micC 유전자를 복제한 다음 돌연변이 50336ΔmicC와 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/p micC를 구성했습니다. 새로운 표적 유전자를 qRT-PCR로 스크리닝하였다. 50336ΔmicC의 독성은 생쥐 및 닭 감염에 의해 검출되었다.

Protocol

모든 실험은 국립연구위원회(National Research Council)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었다. Yangzhou University의 동물 관리 및 사용위원회는 동물에 적용된 모든 실험 및 절차를 승인했습니다 (SYXK2016-0020). 1. 박테리아 균주, 플라스미드 및 배양 조건 표 1에 열거된 박테리아 및 플라스미드를 사용한다. 적…

Representative Results

돌연변이 50336Δ micC 및 보완 균주 50336Δ micC /pmicC의 구성 micC 유전자 클론 결과는 이 유전자가 109 bp로 구성되어 S의 유전자와 100% 동일함을 나타내는 것으로 나타났다. 티피무리움. 서열 데이터를 기반으로 결실 돌연변이 50336ΔmicC와 보완된 돌연변이 50336ΔmicC/p…

Discussion

에스. Enteritidis는 어린 닭을 감염시킬 수 있는 중요한 통성 세포 내 병원체이며 장염에서 전신 감염 및 사망에 이르기까지 증상을 유발합니다17,18. 또한, S. Enteritidis는 성충에게 잠복 감염을 일으키고 만성 보균자는 가금류 제품을 오염시켜 인간에게 식중독 감염을 일으킨다19. S. Enteritidis의 병원성 메커니즘은 더 자세히 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 중국 국립 과학 재단 (Nos. 31972651 및 31101826), 장쑤 고등 교육 과학 재단 (No.14KJB230002), 수의학 생명 공학 국가 핵심 연구소 (No.SKLVBF201509), 양저우 자연 과학 재단 보조금 (No.YZ2014019), 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발 (PAPD)이 자금을 지원하는 프로젝트.

Materials

dextrose Sangon Biotech A610219 for broth preparation
DNA purification kit TIANGEN DP214 for DNA purification
Ex Taq TaKaRa RR01A PCR
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent 10017608 for broth preparation
K2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent 20032116 for broth preparation
L-Arabinose Sangon Biotech A610071 λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit TIANGEN DP106 plasmid extraction
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 for broth preparation
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser  TaKaRa RR047 qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II TaKaRa RR820 qRT-PCR
T4 DNA Ligase NEB M0202 Ligation
TRIzol  Invitrogen 15596018 RNA isolation
Tryptone Oxoid LP0042 for broth preparation
Yeast extract Oxoid LP0021 for broth preparation
centrifuge Eppendorf 5418 centrifugation
Electrophoresis apparatus Bio-Rad 164-5050 Electrophoresis
 Electroporation System Bio-Rad 165-2100 for bacterial transformation
Spectrophotometer BioTek Epoch Absorbance detection
Real-Time PCR system Applied Biosystems 7500 system qRT-PCR

References

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Cite This Article
Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang, J., Wang, J., Zhu, G. A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis. J. Vis. Exp. (167), e61808, doi:10.3791/61808 (2021).

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