Summary

Un petit ARN non codant MicC contribue à la virulence des protéines de la membrane externe chez Salmonella enteritidis

Published: January 27, 2021
doi:

Summary

Un système de recombinaison médiée par λ-Red a été utilisé pour créer un mutant de délétion d’un petit micC à ARN non codant.

Abstract

Un petit ARN non codant (ARNs) est un nouveau facteur pour réguler l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Une sorte d’ARNs MicC, connu chez Escherichia coli et Salmonella Typhimurium, pourrait réprimer l’expression des protéines de la membrane externe. Pour étudier plus avant la fonction de régulation du micC chez Salmonella Enteritidis, nous avons cloné le gène micC dans la souche 50336 de Salmonella Enteritidis, puis construit le mutant 50336Δ micC par le système de recombinaison à base de λ Red et le mutant 50336Δ micC/p micC complété portant le plasmide recombinant pBR322 exprimant micC. Les résultats de la qRT-PCR ont démontré que la transcription de l’ompD dans 50336Δ micC était 1,3 fois plus élevée que celle de la souche de type sauvage, tandis que la transcription de ompA et ompC dans 50336ΔmicC était 2,2 fois et 3 fois plus élevée que celles de la souche de type sauvage. Ceux-ci indiquent que micC réprime l’expression de ompA et ompC. Dans l’étude suivante, la pathogénicité de 50336ΔmicC a été détectée par des souris Balb/c âgées de 6 semaines et des poulets âgés de 1 jour. Le résultat a montré que la DL50 de la souche de type sauvage 50336, les mutants 50336Δ micC et 50336Δ micC/p micC pour les souris Balb/c âgées de 6 semaines étaient respectivement de 12,59UFC, 5,01 UFC et 19,95 UFC. La DL 50 des souches pour les poulets âgés de 1 jour était de 1,13 x 109 UFC, 1,55 x 10 8 UFC et2,54 x 10 8 UFC, respectivement. Il a indiqué que la délétion de micC améliorait la virulence de S. Enteritidis chez la souris et le poulet en régulant l’expression des protéines de la membrane externe.

Introduction

Les petits ARN non codants (ARNs) ont une longueur de 40 à 400 nucléotides, qui ne codent généralement pas pour des protéines mais pourraient être transcrits indépendamment dans les chromosomes bactériens 1,2,3. La plupart des ARNs sont codés dans les régions intergéniques (IGR) entre les régions codant pour les gènes et interagissent avec les ARNm cibles par des actions d’appariement de bases, et régulent l’expression des gènes cibles au niveau post-transcriptionnel 4,5. Ils jouent un rôle régulateur important dans le métabolisme des substances, la synthèse des protéines de la membrane externe, la détection du quorum et l’expression des gènes de virulence5.

MicC est un petit transcrit d’ARN de 109 nucléotides présent dans Escherichia coli et Salmonella enterica sérovar Typhimurium, qui pourrait réguler l’expression de plusieurs protéines de la membrane externe telles que OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 et Omp36 6,7,8,9. MicC régule l’expression de l’OmpC en inhibant la liaison du ribosome au leader de l’ARNm ompC in vitro et nécessite le chaperon d’ARN Hfq pour sa fonction chez Escherichia coli6. Chez Salmonella Typhimurium, MicC réduit au silence l’ARNm ompD via un duplex d’ARN ≤12-bp dans la séquence codante (codons 23-26) puis déstabilise l’ARNm endonucléolytique7. Ce processus de régulation est assisté par la protéine chaperonne Hfq10. L’OmpC est une protéine membranaire externe abondante que l’on croyait importante dans les environnements où les concentrations de nutriments et de toxines étaient élevées, comme dans l’intestin6. La porine OmpD est la protéine membranaire externe la plus abondante chez Salmonella Typhimurium et représente environ 1% de la protéine cellulaire totale11. L’OmpD est impliqué dans l’adhérence aux macrophages humains et aux cellules épithéliales intestinales12. MicC réprime également l’expression des porines OmpC et OmpD. On pense que MicC peut réguler la virulence. Pour explorer de nouveaux gènes cibles régulés par MicC et étudier la fonction de régulation de la virulence de micC, nous avons cloné le gène micC dans la souche 50336 de Salmonella Enteritidis (SE), puis construit le mutant 50336ΔmicC et le mutant complété 50336ΔmicC/p micC. De nouveaux gènes cibles ont été criblés par qRT-PCR. La virulence de 50336ΔmicC a été détectée par des souris et des infections de poulet.

Protocol

Toutes les expériences ont été menées conformément au Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches. Le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yangzhou a approuvé toutes les expériences et procédures appliquées aux animaux (SYXK2016-0020). 1. Souches bactériennes, plasmides et conditions de culture Utilisez les bactéries et les plasmides énumérés dans le tableau 1. <…

Representative Results

Construction du micC mutant 50336Δ et de la souche 50336Δ micC /p micC Le résultat du clone du gène micC indiquait que ce gène était composé de 109 pb montrant une identité de 100% avec celle de S. Typhimurium. Sur la base des données de séquence, le mutant de délétion 50336ΔmicC et le mutant complété 50336ΔmicC/pmicC <…

Discussion

L. Enteritidis est un important agent pathogène intracellulaire facultatif qui peut infecter les jeunes poulets et produire des symptômes allant de l’entérite à l’infection systémique et à la mort17,18. De plus, S. Enteritidis provoque des infections latentes chez les poulets adultes et les porteurs chroniques contaminent les produits avicoles, ce qui entraîne des infections d’origine alimentaire chez les humains19…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale chinoise des sciences (n° 31972651 et 31101826), de la Fondation scientifique du lycée du Jiangsu (n ° 14KJB230002), du Laboratoire clé d’État de biotechnologie vétérinaire (n ° SKLVBF201509), de la subvention de la Fondation des sciences de la nature de Yangzhou (n ° YZ2014019), un projet financé par le développement de programmes académiques prioritaires des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD).

Materials

dextrose Sangon Biotech A610219 for broth preparation
DNA purification kit TIANGEN DP214 for DNA purification
Ex Taq TaKaRa RR01A PCR
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent 10017608 for broth preparation
K2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent 20032116 for broth preparation
L-Arabinose Sangon Biotech A610071 λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit TIANGEN DP106 plasmid extraction
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 for broth preparation
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser  TaKaRa RR047 qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II TaKaRa RR820 qRT-PCR
T4 DNA Ligase NEB M0202 Ligation
TRIzol  Invitrogen 15596018 RNA isolation
Tryptone Oxoid LP0042 for broth preparation
Yeast extract Oxoid LP0021 for broth preparation
centrifuge Eppendorf 5418 centrifugation
Electrophoresis apparatus Bio-Rad 164-5050 Electrophoresis
 Electroporation System Bio-Rad 165-2100 for bacterial transformation
Spectrophotometer BioTek Epoch Absorbance detection
Real-Time PCR system Applied Biosystems 7500 system qRT-PCR

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Cite This Article
Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang, J., Wang, J., Zhu, G. A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis. J. Vis. Exp. (167), e61808, doi:10.3791/61808 (2021).

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