Summary

Un piccolo RNA non codificante MicC contribuisce alla virulenza nelle proteine della membrana esterna in Salmonella enteritidis

Published: January 27, 2021
doi:

Summary

Un sistema di ricombinazione λ-rosso-mediato è stato utilizzato per creare un mutante di delezione di un piccolo microfono di RNA non codificante.

Abstract

Un piccolo RNA non codificante (sRNA) è un nuovo fattore per regolare l’espressione genica a livello post-trascrizionale. Una sorta di sRNA MicC, noto in Escherichia coli e Salmonella Typhimurium, potrebbe reprimere l’espressione delle proteine della membrana esterna. Per studiare ulteriormente la funzione di regolazione della micC in Salmonella Enteritidis, abbiamo clonato il gene micC nel ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis, e poi abbiamo costruito il mutante 50336Δ micC con il sistema di ricombinazione λ Red based e il mutante 50336Δ micC/p micC completato che trasporta il plasmide ricombinante pBR322 che esprime micC. I risultati della qRT-PCR hanno dimostrato che la trascrizione di ompD nel micC 50336Δ era 1,3 volte superiore a quella del ceppo wild type, mentre la trascrizione di ompA e ompC nel micC 50336Δ era 2,2 volte superiore e 3 volte superiore a quella del ceppo wild type. Questi indicano che micC reprime l’espressione di ompA e ompC. Nel seguente studio, la patogenicità di 50336ΔmicC è stata rilevata sia infettando topi Balb / c di 6 settimane che polli di 1 giorno. Il risultato ha mostrato che la LD50 del ceppo wild type 50336, i mutanti 50336Δ micC e 50336Δ micC/pmicC per topi Balb/c di 6 settimane erano rispettivamente 12,59 CFU, 5,01 CFU e 19,95 CFU. I ceppi LD 50 per polli di 1 giorno erano rispettivamente 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU e2,54 x 10 8 CFU. Ha indicato che la delezione del micC ha aumentato la virulenza di S. Enteritidis nei topi e nei polli regolando l’espressione delle proteine della membrana esterna.

Introduction

I piccoli RNA non codificanti (sRNA) sono lunghi 40-400 nucleotidi, che generalmente non codificano proteine ma potrebbero essere trascritti indipendentemente nei cromosomi batterici 1,2,3. La maggior parte degli sRNA sono codificati nelle regioni intergeniche (IGR) tra regioni codificanti geni e interagiscono con gli mRNA bersaglio attraverso azioni di accoppiamento di basi e regolano l’espressione dei geni bersaglio a livello post-trascrizionale 4,5. Svolgono importanti ruoli di regolazione nel metabolismo delle sostanze, nella sintesi proteica della membrana esterna, nel quorum sensing e nell’espressione genica di virulenza5.

MicC è un trascritto di 109 nucleotidi di piccolo RNA presente in Escherichia coli e Salmonella enterica sierotipo Typhimurium, che potrebbe regolare l’espressione di più proteine della membrana esterna come OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 e Omp36 6,7,8,9. MicC regola l’espressione di OmpC inibendo il legame del ribosoma al leader dell’mRNA ompC in vitro e richiede lo chaperone dell’Hfq RNA per la sua funzione in Escherichia coli6. In Salmonella Typhimurium, MicC silenzia l’mRNA ompD attraverso un duplex di RNA ≤12-bp all’interno della sequenza codificante (codoni 23-26) e quindi destabilizza l’mRNA endonucleolitico7. Questo processo di regolazione è assistito dalla proteina chaperone Hfq10. L’OmpC è un’abbondante proteina della membrana esterna che si pensava fosse importante in ambienti in cui le concentrazioni di nutrienti e tossine erano elevate, come nell’intestino6. La porina OmpD è la proteina della membrana esterna più abbondante in Salmonella Typhimurium e rappresenta circa l’1% della proteina cellulare totale11. OmpD è coinvolto nell’aderenza ai macrofagi umani e alle cellule epiteliali intestinali12. MicC reprime anche l’espressione delle porine OmpC e OmpD. Si pensa che MicC possa regolare la virulenza. Per esplorare nuovi geni bersaglio regolati da MicC e studiare la funzione di regolazione della virulenza di micC, abbiamo clonato il gene micC nel ceppo 50336 di Salmonella Enteritidis (SE), quindi abbiamo costruito il mutante 50336ΔmicC e il mutante complementare 50336ΔmicC/p micC. Nuovi geni bersaglio sono stati sottoposti a screening mediante qRT-PCR. La virulenza di 50336ΔmicC è stata rilevata da infezioni da topi e polli.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delle Ricerche. Il comitato per la cura e l’uso degli animali dell’Università di Yangzhou ha approvato tutti gli esperimenti e le procedure applicate sugli animali (SYXK2016-0020). 1. Ceppi batterici, plasmidi e condizioni di coltura Utilizzare i batteri e i plasmidi elencati nella Tabella 1. Batteri di coltura in b…

Representative Results

Costruzione del mutante 50336Δ micC e del ceppo complementare 50336Δ micC /pmicC Il risultato del clone del gene micC ha indicato che questo gene era composto da 109 bp che mostravano un’identità del 100% con quella di S. Typhimurium. Sulla base dei dati di sequenza, il mutante di delezione 50336ΔmicC e il mutante complementare 50336Δ…

Discussion

S. Enteritidis è un importante patogeno intracellulare facoltativo che può infettare i giovani polli e produce sintomi da enterite a infezione sistemica e morte17,18. Inoltre, S. Enteritidis provoca infezioni latenti nei polli adulti e i portatori cronici contaminano i prodotti avicoli, causando infezioni di origine alimentare nell’uomo19. Il meccanismo patogenetico di S. Enteritidis rimane da sondare ulteriormente….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Chinese National Science Foundation (Nos. 31972651 e 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), un progetto finanziato dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

Materials

dextrose Sangon Biotech A610219 for broth preparation
DNA purification kit TIANGEN DP214 for DNA purification
Ex Taq TaKaRa RR01A PCR
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent 10017608 for broth preparation
K2HPO4 Sinopharm Chemical Reagent 20032116 for broth preparation
L-Arabinose Sangon Biotech A610071 λ-Red recombination
Mini Plasmid Kit TIANGEN DP106 plasmid extraction
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308 for broth preparation
(NH4)2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10002917 for broth preparation
PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser  TaKaRa RR047 qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq II TaKaRa RR820 qRT-PCR
T4 DNA Ligase NEB M0202 Ligation
TRIzol  Invitrogen 15596018 RNA isolation
Tryptone Oxoid LP0042 for broth preparation
Yeast extract Oxoid LP0021 for broth preparation
centrifuge Eppendorf 5418 centrifugation
Electrophoresis apparatus Bio-Rad 164-5050 Electrophoresis
 Electroporation System Bio-Rad 165-2100 for bacterial transformation
Spectrophotometer BioTek Epoch Absorbance detection
Real-Time PCR system Applied Biosystems 7500 system qRT-PCR

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Cite This Article
Meng, X., Cui, W., Meng, X., Wang, J., Wang, J., Zhu, G. A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis. J. Vis. Exp. (167), e61808, doi:10.3791/61808 (2021).

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