이 실험 프로토콜은 BCSC 표현형 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 시험 관 내 및 생체 내 분석뿐만 아니라 유방암 세포 및 조직 샘플에서 BCSC의 분리를 설명합니다.
유방암 줄기 세포 (BCSC)는 유전 또는 후천성 줄기 세포와 유사한 특성을 가진 암세포입니다. 낮은 빈도에도 불구하고 유방암 시작, 재발, 전이 및 치료 저항의 주요 원인입니다. 유방암 치료를위한 새로운 치료 표적을 식별하기 위해서는 유방암 줄기 세포의 생물학을 이해하는 것이 필수적입니다. 유방암 줄기 세포는 CD44, CD24와 같은 독특한 세포 표면 마커의 발현 및 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)의 효소 활성을 기반으로 분리 및 특성화됩니다. 이러한 ALDH높은CD44+CD24– 세포는 BCSC 집단을 구성하며 다운스트림 기능 연구를 위한 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 분리될 수 있습니다. 과학적 질문에 따라 BCSC의 기능적 특성을 평가하기 위해 다양한 시험관 내 및 생체 내 방법을 사용할 수 있습니다. 여기에서는 유방암 환자의 이질적인 유방암 집단과 원발성 종양 조직 모두에서 인간 BCSC를 분리하기 위한 상세한 실험 프로토콜을 제공합니다. 또한 BCSC 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 콜로니 형성 분석, 유방권 분석, 3D 배양 모델 및 종양 이종이식 분석을 포함한 다운스트림 시험관 내 및 생체 내 기능 분석을 강조합니다.
인간 유방암 줄기 세포 (BCSC)의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 유방암 치료에서 직면하는 문제를 해결하는 데 중요합니다. BCSC 개념의 출현은 21세기 초로 거슬러 올라가며, CD44+CD24-/저유방암 세포의 작은 집단이 마우스 1,2에서 이질적인 종양을 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다. 그 후, 알데히드 탈수소 효소 (ALDHhigh)의 높은 효소 활성을 갖는 인간 유방암 세포도 유사한 줄기 세포 유사 특성을 나타내는 것으로 관찰되었다3. 이러한 BCSC는자가 재생 및 분화가 가능한 작은 세포 집단을 나타내며 벌크 종양 1,2,3의 이질성에 기여합니다. 축적 된 증거는 진화 적으로 보존 된 신호 전달 경로의 변화가 BCSC 생존 및 유지를 유도한다는 것을 시사합니다 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . 또한, 세포 외인성 미세 환경은 상이한 BCSC 기능을 지시하는데 중추적인 역할을 하는 것으로 나타났다15,16,17. 이러한 분자 경로와 BCSC 기능을 조절하는 외부 요인은 유방암 재발, 전이18 및 치료법에 대한 내성 발달19,20,21에 기여하며, 치료 후 BCSC의 잔류 존재는 유방암 환자의 전체 생존에 큰 도전이 됩니다.22,23 . 따라서 이러한 요인에 대한 전임상 평가는 유방암 환자의 더 나은 치료 결과와 전체 생존 개선을 달성하는 데 도움이 될 수 있는 BCSC 표적 요법을 식별하는 데 매우 중요합니다.
몇몇 시험관내 인간 유방암 세포주 모델 및 생체내 인간 이종이식 모델은 BCSC 24,25,26,27,28,29를 특성화하기 위해 사용되었다. 모든 연속 계대 후에 지속적으로 다시 채워지는 세포주의 능력은 이러한 세포를 오믹스 기반 및 약물유전체학 연구를 수행하는 이상적인 모델 시스템으로 만듭니다. 그러나 세포주는 종종 환자 샘플에서 관찰된 이질성을 요약하지 못합니다. 따라서 환자 유래 샘플로 세포주 데이터를 보완하는 것이 중요합니다. 가장 순수한 형태의 BCSC를 분리하는 것은 BCSC의 상세한 특성 분석을 가능하게 하는 데 중요합니다. 이러한 순도를 달성하는 것은 BCSC에 특정한 표현형 마커의 선택에 달려 있습니다. 현재, ALDH높은CD44+CD24– 세포 표현형은 최대 순도1을 위해 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 벌크 유방암 세포 집단으로부터 인간 BCSC를 구별하고 분리하는 데 가장 일반적으로 사용되며, 3,26. 또한, 자가 갱신, 증식 및 분화와 같은 단리된 BCSC의 특성은 시험관내 및 생체내 기술을 사용하여 평가할 수 있습니다.
예를 들어, 시험관내 콜로니 형성 분석은 상이한 치료 조건(30)의 존재하에50개 이상의 세포의 콜로니를 형성하기 위해 자가갱신하는 단일 세포의 능력을 평가하는데 사용될 수 있다. 유방권 분석은 또한 앵커리지 독립적 조건에서 유방암 세포의 자가 재생 잠재력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 무혈청 비부착성 배양 조건31에서 각각의 연속 계대에서 구체(BCSC 및 비-BCSC의 혼합물)로서 생성 및 성장하는 단일 세포의 능력을 측정합니다. 추가적으로, 3차원(3D) 배양 모델을 사용하여 생체 내 미세환경을 밀접하게 요약하고 잠재적인 BCSC-표적 요법의 활성을 조사할 수 있는 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 포함하는 BCSC 기능을 평가할 수 있다(32). 시험관내 모델의 다양한 응용에도 불구하고, 시험관내 분석만을 사용하여 생체내 조건의 복잡성을 모델링하는 것은 어렵다. 이러한 과제는 생체 내에서 BCSC 거동을 평가하기 위해 마우스 이종이식 모델을 사용함으로써 극복할 수 있습니다. 특히, 이러한 모델은 유방암 전이를 평가하고33, 질병 진행 동안 미세환경과의 상호작용을 조사하고(34), 생체내 영상화(35), 및 항종양제(34)의 환자 특이적 독성 및 효능을 예측하기 위한 이상적인 시스템으로서 기능한다.
이 프로토콜은 이질적인 유방암 세포의 벌크 집단으로부터 최대 순도로 인간 ALDH고 CD44+CD24– BCSC의 분리에 대한 자세한 설명을 제공한다. 또한 BCSC의 다양한 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 세 가지 시험관 내 기술(콜로니 형성 분석, 유방권 분석 및 3D 배양 모델)과 생체 내 종양 이종이식 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이러한 방법은 BCSC 생물학을 이해하고 새로운 BCSC 표적 요법을 조사할 목적으로 인간 유방암 세포주 또는 1차 환자 유래 유방암 세포 및 종양 조직으로부터 BCSC를 분리 및 특성화하는 데 관심이 있는 연구자가 사용하기에 적합합니다.
유방암 전이와 치료에 대한 내성은 전 세계 여성의 주요 사망 원인이되었습니다. 유방암 줄기 세포 (BCSC)의 하위 집단의 존재는 전이 26,43,44,45,46 및 치료 내성 21,47,48의 향상에 기여합니다. 따라서 향후 치…
The authors have nothing to disclose.
유용한 토론과 지원에 대해 실험실 구성원들에게 감사드립니다. 유방암 줄기 세포와 종양 미세 환경에 대한 우리의 연구는 캐나다 암 연구 학회 연구소와 미 육군 국방부 유방암 프로그램 (보조금 # BC160912)의 보조금으로 지원됩니다. VB는 Western Postdoctoral Fellowship (Western University)의 지원을 받고 있으며 ALA와 VB는 모두 캐나다 유방암 학회의 지원을 받고 있습니다. CL은 캐나다 정부의 Vanier Canada 대학원 장학금으로 지원됩니다.
7-Aminoactinomycin D (7AAD) | BD | 51-68981E | suggested: 0.25 µg/1×106 cells |
Acetone | Fisher | A18-1 | |
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate | Stemcell Technologies | 1700 | Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation |
Basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | Sold under the commercial name Matrigel |
Cell culture plates: 6 well | Corning | 877218 | |
Cell culture plates: 60mm | Corning | 353002 | |
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment | Corning | 3474 | |
Cell strainer: 40 micron | BD | 352340 | |
Collagen | Stemcell Technologies | 7001 | Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS |
Collagenase | Sigma | 11088807001 | 1x |
Conical tubes: 50 mL | Fisher scientific | 05-539-7 | |
Crystal violet | Sigma | C6158 | Use 0.05% crystal violet solution in water for staining |
Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | 5U/mL |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
DNAse | Sigma | D5052 | 0.1 mg/mL final concentration |
FBS | Avantor Seradigm Lifescience | 97068-085 | |
Flow tubes: 5ml | BD | 352063 | Polypropylene round-bottom tubes |
Methanol | Fisher | 84124 | |
mouse anti-Human CD24 antibody | BD | 561646 | R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5 |
mouse anti-Human CD44 antibody | BD | 555479 | R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26 |
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stemcell Technologies | 1700 | Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation |
PBS | Wisent Inc | 311-425-CL | 1x, Without calcium and magnesium |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Mammosphere Media Composition | |||
B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
bFGF | Sigma | F2006 | 10 ng/mL |
BSA | Bioshop | ALB003 | 04% |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
EGF | Sigma | E9644 | 20 ng/mL |
Insulin | Sigma | 16634 | 5 µg/mL |
3D Organoid Media Composition | |||
A8301 | Tocris | 2939 | 500 nM |
B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
EGF | Sigma | E9644 | 5 ng/mL |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
FGF7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | 1x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
N-acetylcysteine | Sigma | A9165 | 1.25 mM |
Neuregulin β1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | 5 mM |
Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
R-spondin3 | R&D | 3500 | 250 ng/mL |
SB202190 | Sigma | S7067 | 500 nM |
Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |