פרוטוקול ניסיוני זה מתאר את הבידוד של BCSCs מדגימות תאים ורקמות של סרטן השד, כמו גם את מבחני in vitro ו – in vivo שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הפנוטיפ והתפקוד של BCSC.
תאי גזע של סרטן השד (BCSCs) הם תאים סרטניים בעלי מאפיינים תורשתיים או נרכשים דמויי תאי גזע. למרות התדירות הנמוכה שלהם, הם תורמים עיקריים להתחלת סרטן השד, הישנות, גרורות ועמידות לטיפול. חובה להבין את הביולוגיה של תאי גזע מסרטן השד על מנת לזהות מטרות טיפוליות חדשניות לטיפול בסרטן השד. תאי גזע של סרטן השד מבודדים ומאופיינים על סמך ביטוי של סמני פני שטח ייחודיים של תאים כגון CD44, CD24 ופעילות אנזימטית של אלדהיד דהידרוגנאז (ALDH). תאי CD44+CD24גבוהיםאלה של ALDH מהווים את אוכלוסיית ה-BCSC וניתן לבודד אותם באמצעות מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה (FACS) לצורך מחקרים פונקציונליים במורד הזרם. בהתאם לשאלה המדעית, ניתן להשתמש בשיטות in vitro ו– in vivo שונות כדי להעריך את המאפיינים הפונקציונליים של BCSCs. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניסיוני מפורט לבידוד BCSCs אנושיים הן מאוכלוסיות הטרוגניות של תאי סרטן השד והן מרקמת גידול ראשונית המתקבלת מחולות סרטן השד. בנוסף, אנו מדגישים את הבדיקות הפונקציונליות in vitro ו- in vivo במורד הזרם, כולל מבחנים ליצירת מושבה, מבחני ממוספרה, מודלים של תרביות תלת-ממדיות ומבחני xenograft של גידולים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את תפקוד BCSC.
הבנת המנגנונים התאיים והמולקולריים של תאי גזע מסרטן השד האנושי (BCSCs) היא חיונית להתמודדות עם האתגרים המטופלים בטיפול בסרטן השד. הופעתו של מושג BCSC מתוארכת לתחילת המאהה-21, שם אוכלוסייה קטנה של תאי סרטן שד נמוכים מסוג CD44+CD24/Low נמצאה מסוגלת לייצר גידולים הטרוגניים בעכברים 1,2. לאחר מכן, נצפה כי תאי סרטן שד אנושיים עם פעילות אנזימטית גבוהה של אלדהיד דהידרוגנאז (ALDHגבוה) הציגו גם תכונות דומות דמויות תאי גזע3. BCSCs אלה מייצגים אוכלוסייה קטנה של תאים המסוגלים להתחדשות עצמית והתמיינות, ותורמים לאופי ההטרוגני של גידולים בתפזורת 1,2,3. ראיות מצטברות מצביעות על כך ששינויים במסלולי איתות משומרים אבולוציונית מניעים הישרדות ותחזוקה של BCSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . בנוסף, המיקרו-סביבה החיצונית של התא הוכחה כממלאת תפקיד מרכזי בהכתבת פונקציות BCSC שונות15,16,17. מסלולים מולקולריים אלה והגורמים החיצוניים המווסתים את תפקוד BCSC תורמים להישנות סרטן השד, גרורות18 ופיתוח עמידות לטיפולים 19,20,21, כאשר הקיום השיורי של BCSCs לאחר הטיפול מציב אתגר גדול להישרדות הכוללת של חולות סרטן השד22,23 . לפיכך, הערכה פרה-קלינית של גורמים אלה חשובה מאוד לזיהוי טיפולים ממוקדי BCSC שיכולים להועיל להשגת תוצאות טיפול טובות יותר ולשיפור ההישרדות הכוללת בחולות סרטן השד.
מספר מודלים של קו תאי סרטן שד אנושיים במבחנה ומודלים של קסנוגרפט אנושי in vivo שימשו לאפיון BCSCs 24,25,26,27,28,29. היכולת של קווי תאים להתאכלס מחדש ברציפות לאחר כל מעבר עוקב הופכת אותם למערכת מודל אידיאלית לביצוע מחקרים מבוססי אומיקה ופרמקוגנומיה. עם זאת, קווי תאים לעתים קרובות אינם מצליחים לשחזר את ההטרוגניות שנצפתה בדגימות של מטופלים. לפיכך, חשוב להשלים את נתוני קו התא עם דגימות שמקורן בחולה. בידוד של BCSCs בצורתם הטהורה ביותר חשוב כדי לאפשר אפיון מפורט של BCSCs. השגת טוהר זה תלויה בבחירת סמנים פנוטיפיים ספציפיים ל- BCSCs. נכון לעכשיו, הפנוטיפ של תאי CD44+CD24הגבוהשל ALDH משמש בדרך כלל להבחנה ולבידוד של BCSCs אנושיים מאוכלוסיות תאי סרטן שד בתפזורת באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) לטוהר מרבי1, 3,26. יתר על כן, ניתן להעריך את התכונות של BCSCs מבודדים כגון התחדשות עצמית, התפשטות והתמיינות באמצעות טכניקות in vitro ו– in vivo.
לדוגמה, ניתן להשתמש במבחנים ליצירת מושבות חוץ גופיות כדי להעריך את יכולתו של תא בודד לחדש את עצמו וליצור מושבה של 50 תאים או יותר בנוכחות תנאי טיפול שונים30. ניתן להשתמש במבחני ממוספרה גם כדי להעריך את פוטנציאל ההתחדשות העצמית של תאי סרטן השד בתנאים שאינם תלויים בעוגן. בדיקה זו מודדת את יכולתם של תאים בודדים ליצור ולגדול ככדורים (תערובת של BCSCs ושאינם BCSCs) בכל מעבר עוקב בתנאי תרבית ללא סרוםללא דבק 31. בנוסף, ניתן להשתמש במודלים של תרביות תלת-ממדיות (3D) כדי להעריך את תפקוד ה-BCSC, כולל אינטראקציות תא-תא ומטריצת תאים, אשר מסכמות מקרוב את המיקרו-סביבה in vivo ומאפשרות לחקור את הפעילות של טיפולים פוטנציאליים ממוקדי BCSC32. למרות היישומים המגוונים של מודלים במבחנה, קשה למדל את המורכבות של תנאי in vivo באמצעות מבחני in vitro בלבד. ניתן להתגבר על אתגר זה על ידי שימוש במודלים של xenograft עכבר כדי להעריך את התנהגות BCSC in vivo. בפרט, מודלים אלה משמשים כמערכת אידיאלית להערכת גרורות של סרטן השד33, חקירת אינטראקציות עם המיקרו-סביבה במהלך התקדמות המחלה 34, הדמיה in vivo 35, ולניבוי רעילות ויעילות ספציפיות למטופל של חומרים אנטי-סרטניים34.
פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט לבידוד של CD44+CD24– BCSCsגבוהיםשל ALDH אנושי בטוהר מרבי מאוכלוסיות גדולות של תאי סרטן שד הטרוגניים. אנו מספקים גם תיאור מפורט של שלוש טכניקות in vitro (בדיקת יצירת מושבה, בדיקת ממוספרה ומודל תרבית תלת-ממדית) ובדיקת קסנוגרפט גידול in vivo שניתן להשתמש בה כדי להעריך פונקציות שונות של BCSCs. שיטות אלה יתאימו לשימוש על ידי חוקרים המעוניינים לבודד ולאפיין BCSCs מקווי תאי סרטן שד אנושיים או מתאי סרטן שד שמקורם בחולה ראשוני ורקמת הגידול לצורך הבנת הביולוגיה של BCSC ו/או חקירת טיפולים חדשניים המכוונים ל-BCSC.
גרורות בסרטן השד ועמידות לטיפול הפכו לגורם מרכזי לתמותה בקרב נשים ברחבי העולם. קיומה של תת-אוכלוסייה של תאי גזע מסרטן השד (BCSCs) תורם לעלייה בגרורות 26,43,44,45,46 ולעמידות לטיפול21,47,48.…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על הדיונים המועילים והתמיכה שלהם. המחקר שלנו על תאי גזע של סרטן השד ומיקרו-סביבה של הגידול ממומן על ידי מענקים ממכון המחקר של האגודה הקנדית לחקר הסרטן ומתוכנית סרטן השד של משרד ההגנה האמריקאי (מענק # BC160912). V.B. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מערבית (אוניברסיטת ווסטרן), וגם A.L.A. וגם V.B. נתמכים על ידי האגודה לסרטן השד של קנדה. C.L. נתמכת על ידי מלגת בוגר ונייר קנדה מממשלת קנדה.
7-Aminoactinomycin D (7AAD) | BD | 51-68981E | suggested: 0.25 µg/1×106 cells |
Acetone | Fisher | A18-1 | |
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate | Stemcell Technologies | 1700 | Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation |
Basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | Sold under the commercial name Matrigel |
Cell culture plates: 6 well | Corning | 877218 | |
Cell culture plates: 60mm | Corning | 353002 | |
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment | Corning | 3474 | |
Cell strainer: 40 micron | BD | 352340 | |
Collagen | Stemcell Technologies | 7001 | Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS |
Collagenase | Sigma | 11088807001 | 1x |
Conical tubes: 50 mL | Fisher scientific | 05-539-7 | |
Crystal violet | Sigma | C6158 | Use 0.05% crystal violet solution in water for staining |
Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | 5U/mL |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
DNAse | Sigma | D5052 | 0.1 mg/mL final concentration |
FBS | Avantor Seradigm Lifescience | 97068-085 | |
Flow tubes: 5ml | BD | 352063 | Polypropylene round-bottom tubes |
Methanol | Fisher | 84124 | |
mouse anti-Human CD24 antibody | BD | 561646 | R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5 |
mouse anti-Human CD44 antibody | BD | 555479 | R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26 |
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stemcell Technologies | 1700 | Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation |
PBS | Wisent Inc | 311-425-CL | 1x, Without calcium and magnesium |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Mammosphere Media Composition | |||
B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
bFGF | Sigma | F2006 | 10 ng/mL |
BSA | Bioshop | ALB003 | 04% |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
EGF | Sigma | E9644 | 20 ng/mL |
Insulin | Sigma | 16634 | 5 µg/mL |
3D Organoid Media Composition | |||
A8301 | Tocris | 2939 | 500 nM |
B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
EGF | Sigma | E9644 | 5 ng/mL |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
FGF7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | 1x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
N-acetylcysteine | Sigma | A9165 | 1.25 mM |
Neuregulin β1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | 5 mM |
Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
R-spondin3 | R&D | 3500 | 250 ng/mL |
SB202190 | Sigma | S7067 | 500 nM |
Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |