Dieses experimentelle Protokoll beschreibt die Isolierung von BCSCs aus Brustkrebszell- und Gewebeproben sowie die in vitro und in vivo Assays, die zur Beurteilung des BCSC-Phänotyps und der BCSC-Funktion verwendet werden können.
Brustkrebsstammzellen (BCSCs) sind Krebszellen mit vererbten oder erworbenen stammzellähnlichen Eigenschaften. Trotz ihrer geringen Häufigkeit tragen sie wesentlich zur Entstehung, zum Rückfall, zur Metastasierung und zur Therapieresistenz von Brustkrebs bei. Es ist unerlässlich, die Biologie von Brustkrebsstammzellen zu verstehen, um neue therapeutische Ziele zur Behandlung von Brustkrebs zu identifizieren. Brustkrebsstammzellen werden isoliert und charakterisiert, basierend auf der Expression einzigartiger Zelloberflächenmarker wie CD44, CD24 und der enzymatischen Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDH). Diese ALDHHighCD44+CD24- Zellen bilden die BCSC-Population und können durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) für nachgeschaltete funktionelle Studien isoliert werden. Je nach wissenschaftlicher Fragestellung können unterschiedliche in vitro und in vivo Methoden verwendet werden, um die funktionellen Eigenschaften von BCSCs zu beurteilen. Hier stellen wir ein detailliertes experimentelles Protokoll zur Isolierung von humanen BCSCs sowohl aus heterogenen Populationen von Brustkrebszellen als auch aus primärem Tumorgewebe von Brustkrebspatientinnen zur Verfügung. Darüber hinaus heben wir nachgeschaltete In-vitro – und In-vivo-Funktionstests hervor, einschließlich koloniebildender Assays, Mammosphären-Assays, 3D-Kulturmodelle und Tumor-Xenograft-Assays, die zur Beurteilung der BCSC-Funktion verwendet werden können.
Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen menschlicher Brustkrebsstammzellen (BCSCs) ist entscheidend, um die Herausforderungen bei der Brustkrebsbehandlung zu bewältigen. Die Entstehung des BCSC-Konzepts geht auf das frühe 21. Jahrhundert zurück, als eine kleine Population von CD44+CD24-/niedrigen Brustkrebszellen in der Lage war, heterogene Tumore in Mäusen zu erzeugen 1,2. Anschließend wurde beobachtet, dass menschliche Brustkrebszellen mit hoher enzymatischer Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDHhigh) ebenfalls ähnliche stammzellähnliche Eigenschaften aufwiesen3. Diese BCSCs stellen eine kleine Population von Zellen dar, die zur Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind, was zur heterogenen Natur von Massentumoren beiträgt 1,2,3. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen in evolutionär konservierten Signalwegen das Überleben und die Aufrechterhaltung von BCSC vorantreiben 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die extrinsische Mikroumgebung der Zelle eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung verschiedener BCSC-Funktionen spielt15,16,17. Diese molekularen Signalwege und die externen Faktoren, die die BCSC-Funktion regulieren, tragen zum Rückfall von Brustkrebs, zur Metastasierung18 und zur Entwicklung von Therapieresistenzen bei 19,20,21, wobei die Restexistenz von BCSCs nach der Behandlung eine große Herausforderung für das Gesamtüberleben von Brustkrebspatientinnen darstellt22,23 . Die präklinische Bewertung dieser Faktoren ist daher sehr wichtig, um BCSC-zielgerichtete Therapien zu identifizieren, die für bessere Behandlungsergebnisse und ein verbessertes Gesamtüberleben bei Brustkrebspatientinnen von Vorteil sein könnten.
Mehrere in vitro menschliche Brustkrebs-Zelllinienmodelle und in vivo menschliche Xenograft-Modelle wurden verwendet, um BCSCs 24,25,26,27,28,29 zu charakterisieren. Die Fähigkeit von Zelllinien, sich nach jeder nachfolgenden Passage kontinuierlich neu zu besiedeln, macht diese zu einem idealen Modellsystem für die Durchführung von Omics-basierten und pharmakogenomischen Studien. Zelllinien können jedoch die in Patientenproben beobachtete Heterogenität oft nicht rekapitulieren. Daher ist es wichtig, Zellliniendaten mit Patientenproben zu ergänzen. Die Isolierung von BCSCs in ihrer reinsten Form ist wichtig, um eine detaillierte Charakterisierung von BCSCs zu ermöglichen. Das Erreichen dieser Reinheit hängt von der Auswahl der phänotypischen Marker ab, die für BCSCs spezifisch sind. Derzeit wird der ALDH-Zellphänotypmit hohemCD44+CD24-Zellgehalt am häufigsten verwendet, um humane BCSCs aus Massen-Brustkrebszellpopulationen zu unterscheiden und zu isolieren, wobei Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für maximale Reinheit verwendet wird 1, 3,26. Darüber hinaus können die Eigenschaften isolierter BCSCs wie Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung mit in vitro und in vivo Techniken bewertet werden.
Zum Beispiel können In-vitro-Koloniebildungsassays verwendet werden, um die Fähigkeit einer einzelnen Zelle zu beurteilen, sich selbst zu erneuern, um eine Kolonie von 50 Zellen oder mehr bei unterschiedlichen Behandlungsbedingungen zu bilden30. Mammosphären-Assays können auch verwendet werden, um das Selbsterneuerungspotenzial von Brustkrebszellen unter verankerten Bedingungen zu beurteilen. Dieser Assay misst die Fähigkeit einzelner Zellen, bei jeder nachfolgenden Passage unter serumfreien, nicht adhärenten Kulturbedingungen als Kugeln (Mischung aus BCSCs und Nicht-BCSCs) zu erzeugen und zu wachsen31. Darüber hinaus können 3-dimensionale (3D) Kulturmodelle verwendet werden, um die BCSC-Funktion zu bewerten, einschließlich Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, die die In-vivo-Mikroumgebung genau rekapitulieren und die Untersuchung der Aktivität potenzieller BCSC-zielgerichteter Therapien ermöglichen32. Trotz der vielfältigen Anwendungen von In-vitro-Modellen ist es schwierig, die Komplexität von In-vivo-Bedingungen nur mit In-vitro-Assays zu modellieren. Diese Herausforderung kann durch die Verwendung von Maus-Xenograft-Modellen zur Bewertung des BCSC-Verhaltens in vivo überwunden werden. Insbesondere dienen solche Modelle als ideales System zur Beurteilung der Brustkrebsmetastasierung33, zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung während des Krankheitsverlaufs 34, zur In-vivo-Bildgebung 35 und zur Vorhersage der patientenspezifischen Toxizität und Wirksamkeit von Antitumorwirkstoffen 34.
Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung für die Isolierung von humanen ALDHhohenCD44+CD24– BCSCs in maximaler Reinheit aus Massenpopulationen heterogener Brustkrebszellen. Wir bieten auch eine detaillierte Beschreibung von drei In-vitro-Techniken (koloniebildender Assay, Mammosphärentest und 3D-Kulturmodell) und einen In-vivo-Tumor-Xenograft-Assay, der zur Beurteilung verschiedener Funktionen von BCSCs verwendet werden kann. Diese Methoden wären für Forscher geeignet, die an der Isolierung und Charakterisierung von BCSCs aus menschlichen Brustkrebszelllinien oder primär von Patienten abgeleiteten Brustkrebszellen und Tumorgewebe interessiert sind, um die BCSC-Biologie zu verstehen und/oder neuartige BCSC-zielgerichtete Therapien zu untersuchen.
Brustkrebsmetastasen und Therapieresistenzen sind weltweit zu einer Haupttodesursache bei Frauen geworden. Die Existenz einer Subpopulation von Brustkrebsstammzellen (BCSCs) trägt zur verstärkten Metastasierung 26,43,44,45,46 und Therapieresistenz21,47,48 bei. Daher…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für ihre hilfreichen Gespräche und Unterstützung. Unsere Forschung zu Brustkrebsstammzellen und der Tumormikroumgebung wird durch Zuschüsse des Canadian Cancer Research Society Research Institute und des Brustkrebsprogramms des US-Verteidigungsministeriums (Grant # BC160912) finanziert. V.B. wird durch ein Western Postdoctoral Fellowship (Western University) unterstützt, und sowohl A.L.A. als auch V.B. werden von der Breast Cancer Society of Canada unterstützt. C.L. wird durch ein Vanier Canada Graduate Scholarship der kanadischen Regierung unterstützt.
7-Aminoactinomycin D (7AAD) | BD | 51-68981E | suggested: 0.25 µg/1×106 cells |
Acetone | Fisher | A18-1 | |
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate | Stemcell Technologies | 1700 | Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation |
Basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | Sold under the commercial name Matrigel |
Cell culture plates: 6 well | Corning | 877218 | |
Cell culture plates: 60mm | Corning | 353002 | |
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment | Corning | 3474 | |
Cell strainer: 40 micron | BD | 352340 | |
Collagen | Stemcell Technologies | 7001 | Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS |
Collagenase | Sigma | 11088807001 | 1x |
Conical tubes: 50 mL | Fisher scientific | 05-539-7 | |
Crystal violet | Sigma | C6158 | Use 0.05% crystal violet solution in water for staining |
Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | 5U/mL |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
DNAse | Sigma | D5052 | 0.1 mg/mL final concentration |
FBS | Avantor Seradigm Lifescience | 97068-085 | |
Flow tubes: 5ml | BD | 352063 | Polypropylene round-bottom tubes |
Methanol | Fisher | 84124 | |
mouse anti-Human CD24 antibody | BD | 561646 | R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5 |
mouse anti-Human CD44 antibody | BD | 555479 | R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26 |
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stemcell Technologies | 1700 | Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation |
PBS | Wisent Inc | 311-425-CL | 1x, Without calcium and magnesium |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Mammosphere Media Composition | |||
B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
bFGF | Sigma | F2006 | 10 ng/mL |
BSA | Bioshop | ALB003 | 04% |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
EGF | Sigma | E9644 | 20 ng/mL |
Insulin | Sigma | 16634 | 5 µg/mL |
3D Organoid Media Composition | |||
A8301 | Tocris | 2939 | 500 nM |
B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
EGF | Sigma | E9644 | 5 ng/mL |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
FGF7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | 1x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
N-acetylcysteine | Sigma | A9165 | 1.25 mM |
Neuregulin β1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | 5 mM |
Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
R-spondin3 | R&D | 3500 | 250 ng/mL |
SB202190 | Sigma | S7067 | 500 nM |
Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |