Ce protocole expérimental décrit l’isolement des CSCA à partir d’échantillons de cellules et de tissus cancéreux du sein ainsi que les tests in vitro et in vivo qui peuvent être utilisés pour évaluer le phénotype et la fonction des CSBC.
Les cellules souches du cancer du sein (CSBC) sont des cellules cancéreuses dont les caractéristiques héréditaires ou acquises ressemblent à des cellules souches. Malgré leur faible fréquence, elles contribuent grandement à l’initiation du cancer du sein, aux rechutes, aux métastases et à la résistance au traitement. Il est impératif de comprendre la biologie des cellules souches du cancer du sein afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter le cancer du sein. Les cellules souches du cancer du sein sont isolées et caractérisées en fonction de l’expression de marqueurs de surface cellulaire uniques tels que CD44, CD24 et l’activité enzymatique de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDH). Ces cellules ALDHà CD44+CD24– élevé constituent la population BCSC et peuvent être isolées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour des études fonctionnelles en aval. Selon la question scientifique, différentes méthodes in vitro et in vivo peuvent être utilisées pour évaluer les caractéristiques fonctionnelles des BCSC. Ici, nous fournissons un protocole expérimental détaillé pour l’isolement des BCSC humains à partir de populations hétérogènes de cellules cancéreuses du sein ainsi que de tissus tumoraux primaires obtenus à partir de patientes atteintes d’un cancer du sein. En outre, nous mettons en évidence des tests fonctionnels in vitro et in vivo en aval, y compris des tests de formation de colonies, des tests de mammosphère, des modèles de culture 3D et des tests de xénogreffe tumorale qui peuvent être utilisés pour évaluer la fonction BCSC.
Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires des cellules souches du cancer du sein humain (CSCA) est crucial pour relever les défis rencontrés dans le traitement du cancer du sein. L’émergence du concept BCSC remonte au début du 21esiècle, où une petite population de cellules cancéreuses du sein CD44 + CD24 / faible s’est avérée capable de générer des tumeurs hétérogènes chez la souris 1,2. Par la suite, il a été observé que les cellules cancéreuses du sein humain ayant une activité enzymatique élevée de l’aldéhyde déshydrogénase (ALDHélevée) présentaient également des propriétés similaires à celles des cellules souches3. Ces BCSC représentent une petite population de cellules capables de s’auto-renouveler et de se différencier, contribuant à la nature hétérogène des tumeurs en vrac 1,2,3. L’accumulation de preuves suggère que les altérations des voies de signalisation conservées au cours de l’évolution déterminent la survie et le maintiende la BCSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . En outre, il a été démontré que le microenvironnement extrinsèque cellulaire joue un rôle central dans la dictée des différentes fonctions BCSC15,16,17. Ces voies moléculaires et les facteurs externes régulant la fonction BCSC contribuent à la rechute du cancer du sein, aux métastases18 et au développement d’une résistance aux thérapies 19,20,21, l’existence résiduelle de BCSC post-traitement posant un défi majeur pour la survie globale des patientes atteintes d’un cancer du sein22,23 . L’évaluation préclinique de ces facteurs est donc très importante pour identifier les thérapies ciblant le BCSC qui pourraient être bénéfiques pour obtenir de meilleurs résultats de traitement et améliorer la survie globale chez les patientes atteintes d’un cancer du sein.
Plusieurs modèles in vitro de lignées cellulaires de cancer du sein humain et modèles in vivo de xénogreffes humaines ont été utilisés pour caractériser les CSCA 24,25,26,27,28,29. La capacité des lignées cellulaires à se repeupler continuellement après chaque passage successif en fait un système modèle idéal pour effectuer des études omiques et pharmacogénomiques. Cependant, les lignées cellulaires ne parviennent souvent pas à récapituler l’hétérogénéité observée dans les échantillons de patients. Par conséquent, il est important de compléter les données de lignées cellulaires avec des échantillons dérivés de patients. L’isolement des CSCA dans leur forme la plus pure est important pour permettre une caractérisation détaillée des CSCA. L’atteinte de cette pureté dépend de la sélection de marqueurs phénotypiques spécifiques aux CSBC. Actuellement, le phénotypeALDH à CD44+CD24– élevé est le plus souvent utilisé pour distinguer et isoler les BCSC humaines des populations de cellules cancéreuses du sein en vrac en utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour une pureté maximale1, 3,26. De plus, les propriétés des BCSC isolées, telles que l’auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation, peuvent être évaluées à l’aide de techniques in vitro et in vivo.
Par exemple, les essais in vitro formant des colonies peuvent être utilisés pour évaluer la capacité d’une seule cellule à s’auto-renouveler pour former une colonie de 50 cellules ou plus en présence de différentes conditions de traitement30. Les tests de mammosphère peuvent également être utilisés pour évaluer le potentiel d’auto-renouvellement des cellules cancéreuses du sein dans des conditions indépendantes de l’ancrage. Ce test mesure la capacité de cellules individuelles à générer et à se développer sous forme de sphères (mélange de BCSC et de non-BCSC) à chaque passage successif dans des conditions de culture non adhérentes sans sérum31. De plus, des modèles de culture en 3 dimensions (3D) peuvent être utilisés pour évaluer la fonction BCSC, y compris les interactions cellule-cellule et cellule-matrice qui récapitulent étroitement le microenvironnement in vivo et permettent d’étudier l’activité des thérapies potentielles ciblant le BCSC32. Malgré les diverses applications des modèles in vitro, il est difficile de modéliser la complexité des conditions in vivo en utilisant uniquement des essais in vitro. Ce défi peut être surmonté en utilisant des modèles de xénogreffes de souris pour évaluer le comportement de BCSC in vivo. En particulier, ces modèles constituent un système idéal pour évaluer les métastases du cancer du sein33, étudier les interactions avec le microenvironnement au cours de la progression de la maladie 34, l’imagerie in vivo 35 et prédire la toxicité et l’efficacité spécifiques au patient des agents antitumoraux 34.
Ce protocole fournit une description détaillée de l’isolement des BCSC humains à CD44+CD24– élevés en ALDHà unepureté maximale à partir de populations en vrac de cellules hétérogènes du cancer du sein. Nous fournissons également une description détaillée de trois techniques in vitro (test de formation de colonies, test de mammosphère et modèle de culture 3D) et un test de xénogreffe tumorale in vivo qui peut être utilisé pour évaluer différentes fonctions des BCSC. Ces méthodes seraient appropriées pour les chercheurs intéressés à isoler et à caractériser les CSCA à partir de lignées cellulaires de cancer du sein humain ou de cellules cancéreuses du sein et de tissus tumoraux dérivés de patients primaires dans le but de comprendre la biologie du BCSC et/ou d’étudier de nouvelles thérapies ciblant le BCSC.
Les métastases du cancer du sein et la résistance au traitement sont devenues des causes majeures de mortalité chez les femmes dans le monde entier. L’existence d’une sous-population de cellules souches du cancer du sein (CSBC) contribue à l’augmentation des métastases 26,43,44,45,46 et à la résistance au traitement21,47,48.</sup…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leurs discussions utiles et leur soutien. Notre recherche sur les cellules souches du cancer du sein et le microenvironnement tumoral est financée par des subventions de l’Institut de recherche de la Société canadienne de recherche sur le cancer et du U.S. Army Department of Defense Breast Cancer Program (subvention # BC160912). V.B. est soutenu par une bourse postdoctorale Western (Université Western), et A.L.A. et V.B. sont soutenus par la Société du cancer du sein du Canada. C.L. est soutenu par une bourse d’études supérieures du Canada Vanier du gouvernement du Canada.
7-Aminoactinomycin D (7AAD) | BD | 51-68981E | suggested: 0.25 µg/1×106 cells |
Acetone | Fisher | A18-1 | |
Aldehyde dehydrogenase (ALDH) substrate | Stemcell Technologies | 1700 | Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions for ALDH substrate preparation |
Basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | Sold under the commercial name Matrigel |
Cell culture plates: 6 well | Corning | 877218 | |
Cell culture plates: 60mm | Corning | 353002 | |
Cell culture plates: 96-well ultra low attachment | Corning | 3474 | |
Cell strainer: 40 micron | BD | 352340 | |
Collagen | Stemcell Technologies | 7001 | Prepare 1:30 dilution of 3 mg/mL collagen in PBS |
Collagenase | Sigma | 11088807001 | 1x |
Conical tubes: 50 mL | Fisher scientific | 05-539-7 | |
Crystal violet | Sigma | C6158 | Use 0.05% crystal violet solution in water for staining |
Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | 5U/mL |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
DNAse | Sigma | D5052 | 0.1 mg/mL final concentration |
FBS | Avantor Seradigm Lifescience | 97068-085 | |
Flow tubes: 5ml | BD | 352063 | Polypropylene round-bottom tubes |
Methanol | Fisher | 84124 | |
mouse anti-Human CD24 antibody | BD | 561646 | R-phycoerythrin and Cyanine dye conjugated Clone: ML5 |
mouse anti-Human CD44 antibody | BD | 555479 | R-phycoerythrin conjugated, Clone: G44-26 |
N,N-diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stemcell Technologies | 1700 | Sold commerically as part of the ALDEFLOUR Assay kit; follow manufacturer's instructions DEAB preparation |
PBS | Wisent Inc | 311-425-CL | 1x, Without calcium and magnesium |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Mammosphere Media Composition | |||
B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
bFGF | Sigma | F2006 | 10 ng/mL |
BSA | Bioshop | ALB003 | 04% |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
EGF | Sigma | E9644 | 20 ng/mL |
Insulin | Sigma | 16634 | 5 µg/mL |
3D Organoid Media Composition | |||
A8301 | Tocris | 2939 | 500 nM |
B27 | Gibco | 17504-44 | 1x |
DMEM:F12 | Gibco | 11330-032 | 1x, With L-glutamine and 15 mM HEPES |
EGF | Sigma | E9644 | 5 ng/mL |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
FGF7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | 1x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 10 mM |
N-acetylcysteine | Sigma | A9165 | 1.25 mM |
Neuregulin β1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | 5 mM |
Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
R-spondin3 | R&D | 3500 | 250 ng/mL |
SB202190 | Sigma | S7067 | 500 nM |
Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |