Un modelo de imagen neonatal de sepsis bacteriana gram-negativa
Summary
La infección de ratones neonatales con E. coli O1:K1:H7 bioluminiscente produce una infección séptica con inflamación pulmonar significativa y patología pulmonar. Aquí, describimos procedimientos para modelar y estudiar más a fondo la sepsis neonatal utilizando imágenes intravitales longitudinales en paralelo con la enumeración de cargas bacterianas sistémicas, perfiles inflamatorios e histopatología pulmonar.
Abstract
Los neonatos tienen un mayor riesgo de sepsis bacteriana debido al perfil inmune único que muestran en los primeros meses de vida. Hemos establecido un protocolo para estudiar la patogénesis de E. coli O1:K1:H7, un serotipo responsable de altas tasas de mortalidad en neonatos. Nuestro método utiliza imágenes intravitales de cachorros neonatales en diferentes momentos durante la progresión de la infección. Esta imagen, paralela a la medición de bacterias en la sangre, el perfilo inflamatorio y la histopatología tisular, significa un enfoque riguroso para entender la dinámica de la infección durante la sepsis. En el informe actual, modelamos dos inóculos infecciosos para la comparación de las cargas bacterianas y la gravedad de la enfermedad. Encontramos que la infección subescapular conduce a la infección diseminada por 10 h después de la infección. A las 24 horas, la infección de E. coli luminiscente era abundante en la sangre, los pulmones y otros tejidos periféricos. La expresión de citoquinas inflamatorias en los pulmones es significativa a las 24 h, y esto es seguido por la infiltración celular y la evidencia de daño tisular que aumenta con la dosis infecciosa. Las imágenes intravitales tienen algunas limitaciones. Esto incluye un umbral de señal luminiscente y algunas complicaciones que pueden surgir con los neonatos durante la anestesia. A pesar de algunas limitaciones, encontramos que nuestro modelo de infección ofrece una visión para entender la dinámica longitudinal de la infección durante la sepsis murina neonatal, que no ha sido examinada a fondo hasta la fecha. Esperamos que este modelo también se pueda adaptar para estudiar otras infecciones bacterianas críticas durante la vida temprana.
Introduction
La sepsis bacteriana es una preocupación significativa para los neonatos que presentan un perfil inmune único en los primeros días de vida que no proporciona una protección adecuada contra la infección1. La sepsis neonatal sigue siendo un problema de atención médica importante en los Estados Unidos que representa más de 75.000 casos anuales solo en los Estados Unidos2. Para estudiar estas infecciones en profundidad, se requieren nuevos modelos animales que recapitulan aspectos de la enfermedad humana. Hemos establecido un modelo de infección de ratón neonatal utilizando Escherichia coli,O1:K1:H73. E. coli es la segunda causa principal de sepsis neonatal en los Estados Unidos, pero responsable de la mayoría de la mortalidad asociada a la sepsis4,5. Sin embargo, es la causa principal cuando los bebés prematuros y con muy bajo peso al nacer (VLBW) se consideran independientemente5. El serotipo K1 se asocia con mayor frecuencia con infecciones invasivas del torrente sanguíneo y meningitis en neonatos6,7. Actualmente, no hay otras opciones de tratamiento más allá de los antibióticos y la atención de apoyo. Mientras tanto, las tasas de resistencia a los antibióticos siguen aumentando para muchas bacterias patógenas, con algunas cepas de E. coli resistentes a una multitud de antibióticos comúnmente utilizados en el tratamiento8. Por lo tanto, es imperativo que sigamos generando métodos para estudiar los mecanismos de la sepsis y la respuesta del huésped en los neonatos. Estos resultados pueden ayudar a mejorar los tratamientos actuales y los resultados de la infección.
El estado inmunológico de los neonatos se caracteriza por diferencias fenotípicas y funcionales en comparación con los adultos. Por ejemplo, se ha demostrado que los niveles elevados de citoquinas antiinflamatorias y reglamentarias, como la interleucina (IL)-10 y la IL-27, se producen por macrófagos derivados de la sangre del cordón umbilical y están presentes a niveles mayores en el suero de neonatos muriados9,10,11. Esto es consistente con los niveles más bajos de α IFN, IFN-ɣ, IL-12 y TNF-α que se notifican con frecuencia de células neonatales en comparación con las contrapartes adultas10. Además, el sistema inmunitario neonatal está sesgado hacia una respuesta de la célula T Th2 y reguladora en comparación con los adultos12. Un número elevado de neutrófilos, células T, células B, células NK y monocitos también están presentes en los neonatos, pero con deficiencias funcionales significativas. Esto incluye defectos en la expresión de marcadores de superficie celular y presentación de antígenos que sugieren inmadurez13,14,15. Además, los neutrófilos neonatales son significativamente deficientes en su capacidad de migrar a factores quimiotácticos16. Las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) también se encuentran en niveles elevados en neonatos y recientemente se ha demostrado que son una fuente de IL-2711. Los MDSC son altamente supresivos hacia las células T17. Colectivamente, estos datos demuestran limitaciones en la inmunidad neonatal que prestan a una mayor susceptibilidad a la infección.
Para estudiar la progresión de la carga bacteriana y diseccionar las respuestas inmunitarias del huésped protector durante la sepsis neonatal, hemos desarrollado un nuevo modelo de infección. Los ratones neonatales en los días 3-4 de vida son difíciles de inyectar en el espacio intraperitoneal o en la vena de la cola. En nuestro modelo, día 3 o 4 cachorros se administran el inóculo bacteriano o PBS por vía subcutánea en la región escapular. Una infección sistémica se desarrolla y utilizando E. coli luminiscente O1:K1:H7, podemos imaginar longitudinalmente ratones neonatales individuales para seguir la carga bacteriana diseminada en los tejidos periféricos. Este es el primer modelo reportado para utilizar imágenes intravitales para entender la cinética de la diseminación de bacterias durante la sepsis en neonatos muridos3.
Aquí, describimos un protocolo para inducir infecciones sépticas de E. coli en ratones neonatales3. Describimos cómo preparar el inóculo bacteriano para inyección, y cómo cosechar tejido para la evaluación de la patología, la medición de marcadores inflamatorios por análisis de expresión génica, y la enumeración de la carga bacteriana. Además, también se describe el uso de E. coli luminiscente para imágenes intravitales de neonatos infectados y la cuantificación de la matanza bacteriana por parte de células inmunitarias neonatales. Estos protocolos también pueden adaptarse para estudiar otras infecciones bacterianas importantes en neonatos. Los datos presentados aquí representan un enfoque novedoso general para entender la dinámica de la infección en un modelo de sepsis neonatal traducible.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro modelo de infección subescapular para inducir sepsis bacteriana en ratones neonatales es un método novedoso para estudiar la propagación longitudinal de patógenos bacterianos en tiempo real. La imagen intravital ofrece la oportunidad de explorar la diseminación bacteriana en tiempo real en neonatos. Esto es fundamental para entender la cinética de la diseminación bacteriana y para seguir estudiando la respuesta del huésped y el daño en la fase apropiada de la enfermedad. A los cachorros de ratón se les …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos institucionales a C.M.R.
Materials
| 1 mL Insulin Syringe | Coviden | 1188128012 | Inoculum or PBS injection |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370-094 | Histopathology |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | LSA1049201 | Bacterial clearance assay |
| Animal Tattoo Ink Paste | Ketchum | KI1482039 | Animal identification |
| Animal Tattoo Ink Green Paste | Ketchum | KI1471039 | Animal identification |
| Anti-Ly-6B.2 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-100-781 | Cell isolation |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | |
| Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase) | N/A | N/A | Constructed in-house at WVU |
| E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit | Omega Bio-tek | R6812 | RNA extration |
| DPBS, 1X | Corning | 21-031-CV | |
| Difco Tryptic Soy Agar | Becton, Dickinson and Company | 236950 | Bacterial growth |
| IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| IL-6 Primer/Probe (Mm00446190) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| iQ Supermix | Bio-Rad | 1708860 | Real-time quantitative PCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| Isolation Buffer | Miltenyi Biotec | N/A | Bacterial clearance assay |
| IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software | Perkin Elmer | N/A | Intravital imaging |
| LB Broth, Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | Bacterial growth |
| EASYstrainer (Nylon Basket) | Greiner Bio-one | 542 040 | Cell strainer |
| SpectraMax iD3 | Molecular Devices | N/A | Plate reader |
| Pellet Pestle Motor | Grainger | 6HAZ6 | Tissue homogenization |
| Polypropylene Pellet Pestles | Grainger | 6HAY5 | Tissue homogenization |
| Prime Thermal Cycler | Techne | 3PRIMEBASE/02 | cDNA synthesis |
| TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Cytokine expression qPCR |
| TriReagent (GTCP) | Molecular Research Center | TR 118 | RNA extration |
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